離心微流控芯片技術用于核酸等溫擴增的研究進展

曹 寧， 周新麗

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093

食品安全在現代社會引發越來越廣泛的關注，出現許多由食源致病菌的污染食品造成頻發的食品安全事件，而早期對致病菌進行分子診斷可有效防止后期產生嚴重損害。在致病菌檢測早期，標志物的檢測水平通常非常低[1]，需要采用核酸擴增技術來擴增脫氧核糖核酸(Deoxyribo Nucleic Acid，DNA)和核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，拷貝大量目標核酸，顯著提高反應靈敏度[2]。核酸擴增技術包含常規聚合酶鏈式反應[3](Polymerase Chain Reaction，PCR)、核酸等溫擴增等技術。其中，核酸等溫擴增技術操作簡單，僅需要一個恒溫平臺，便能使樣品進行高效、快速的核酸擴增反應，但仍需要專業的檢測人員操作，不宜在現場及基層推廣[4]。

微流控技術是將傳統實驗室的基本功能整合到一個只有幾平方厘米的芯片上，僅通過皮升或微升體積的微量流體，便能實現生化分析的各個步驟。此方法具有微型化、集成化、高通量、自動化的優勢，為實現現場檢測、低成本的生化分析提供了一條經濟簡便的檢測技術途徑。目前微流控檢測芯片已廣泛應用于血液檢測[5, 6]、藥物篩選[7,8]、核酸分析[9,10]、水質分析[11,12]及食品檢測[13,14]等方面。微流控芯片的驅動方式分為機械驅動及非機械驅動。機械驅動主要是利用自身部件的運動來達到驅動的目的，包括各種微泵驅動[15]、磁珠驅動[16]和離心力驅動[17]等，非機械驅動方式包括毛細管作用力驅動[18]，電動驅動[19]等。離心力驅動芯片是機械驅動中的一種，與微泵驅動、磁珠驅動等機械驅動的不同在于，其不需要連接外部任何其他接口，可實現分析系統的集成性及簡便性。由于離心重力場的作用，離心式芯片可以簡便去除可能干擾測定的任何氣泡，并且通過調節通道的長度及旋轉速度，實現不同大小的離心力，僅通過簡單主軸電機即可驅動數十或者數百個獨立的結構單元，可在芯片上對樣品進行分子診斷及檢測分析[20]。

近年來，越來越多的研究表明將離心微流控芯片技術與核酸等溫擴增技術結合，具有微量化、集成化、自動化等特點，在食品安全、環境保護、醫療衛生等領域展現巨大的發展潛力。本論文介紹了離心微流控芯片技術用于核酸等溫擴增的研究進展，包括離心微流控芯片技術用于核酸提取、試劑的預存儲，重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、環介導等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)、依賴核酸序列擴增(Nucleic Acid Sequence-dependent Amplification,NASBA)三種核酸等溫擴增方法中的應用。最后，對離心微流控技術用于核酸等溫擴增存在的問題和可能的發展方向進行了分析。

1 離心微流控芯片技術用于核酸擴增前處理

1.1 核酸提取

在進行核酸擴增檢測之前，首先要進行樣品中的核酸提取。提取樣品中的核酸，真核細胞或細菌需要進行裂解，使核酸易于純化或濃縮，提取高質量的DNA、RNA是檢測成功的關鍵[21-24]。離心式芯片上DNA的提取及純化常采用磁珠或二氧化硅珠機械裂解法。該方法需要三個主要步驟：樣品DNA與珠子相的結合、珠子洗滌以及DNA純化、DNA的洗脫。

STUMPF F等[25]使用磁珠在芯片上進行核酸提取，磁珠為固定相。如圖1A所示，將磁珠預存儲于芯片腔室(c)中，并將結合液、裂解液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液通過鋁復合箔棒狀包裝預存儲于(b)從右至左的五個不同腔室內。樣品從進樣腔(a)加入，在電機頻率為55 Hz的條件下將裂解液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液RNA提取緩沖液從棒狀包裝中釋放出并分別轉移至裂解結合腔(c)、洗滌腔1(d)和洗滌腔2(e)和洗脫腔(f)。調節轉速為80 Hz將結合液包裝破裂并添加至裂解結合腔(c)裂解樣品中，使RNA與磁珠結合。通過使用外部移動磁鐵的方法依次通過核酸提取腔室(c-f)得到純化后的RNA。最后提取出純化后的RNA驅動到微流體通道區域(g)中，使用10 Hz的頻率使洗脫液泵送到等分結構(h)中，然后轉移至反應腔(i)中進行后續擴增檢測。

另一方法，使用二氧化硅珠以提取核酸，硅珠為固定相。JUNG J H等[26]研究出將硅珠以低凹結構填充在微通道中，不論旋轉速度和方向如何，這種珠床都是固定的。如圖1B所示，將樣品加入進樣腔(a)中，由于芯片的親水性，樣品自動流入含有硅珠的微通道(b)中，硅珠將RNA樣品及一些雜質捕獲。洗滌液、洗脫液和RT-LAMP反應混合液分別裝入洗滌腔(c)、洗脫腔(d)及RT-LAMP存儲腔(e)，以5 000 r/min的速度離心10 s，先釋放洗滌液，去除殘留在硅珠上的鹽、蛋白質，通過虹吸閥的設計再釋放洗脫液，洗脫硅珠上純化后的RNA，然后以5 000 r/min的速度逆時針離心290 s完全干燥微珠中的任何殘留乙醇，核酸提取的廢棄液體由驅動力移動至廢液腔(g)。將驅動設備停止30 s，在進樣腔(a)中加入無核酸酶水，RT-LAMP存儲腔(e)中的反應混合液釋放至虹吸閥，以5 000 r/min的速度順時針旋轉90 s，純化后的RNA與RT-LAMP混合液轉移至反應腔(f)并進行后續擴增檢測。離心式芯片需要精密設計的微通道和腔室才能夠僅通過主軸電機進行核酸的提取及純化。

1.2 試劑的預存儲

試劑的預存儲能夠有效避免來自不同生產批次的試劑的混合，有助于減少交叉污染，增強檢測效果，減少在檢測過程中手動添加試劑。預存儲可細分為干燥試劑和液體試劑的存儲，由于預存儲試劑(例如緩沖液和溶劑)需要低溫、隔氧、避光保存等性質，其長期預存儲是一個巨大的挑戰。

使用干燥形式進行試劑的預存儲，通常是在芯片封裝之前將預存儲試劑添加到聚合物芯片反應室內，然后將試劑進行冷凍干燥，之后再對芯片進行封裝。通過優化合適的冷凍干燥參數，凍干試劑能夠長期在室溫下穩定存儲。對于液體試劑，可以預先存儲在單獨的容器中，也可以直接注入離心式芯片的腔室中。STUMPF F等[25]提出了由不透氣的鋁復合箔制成微型包裝，能夠在制造過程中改變微型包裝的密封參數，實現在不同的離心力下分批次破裂釋放緩沖液，可用于PCR試劑補充液或緩沖液的釋放(圖1C)。LUTZ S等[27]證明了用于DNA提取的液體試劑的長期穩定預存儲。將RPA緩沖液封裝在玻璃包裝中進行密封，然后將其放在芯片內。當進行檢測時，首先將玻璃瓶手動壓碎將試劑釋放到微流體結構中，再進行后續檢測(圖1D)。

2 離心微流控芯片技術用于核酸等溫擴增

核酸等溫擴增技術能夠使用恒定溫度對DNA、RNA進行擴增，操作過程較PCR技術簡單很多，在現場檢測的研究中展現出良好的應用前景。下面介紹離心微流控芯片技術在重組酶聚合酶擴增(RPA)、環介導等溫擴增(LAMP)、依賴核酸序列擴增(NASBA)三種核酸等溫擴增方法中的應用。

2.1 重組酶聚合酶擴增(RPA)

重組酶聚合酶擴增(RPA)僅需要一種能夠結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶，單鏈DNA結合蛋白(SSB)與被取代的 DNA 鏈結合，DNA聚合酶在室溫或37 ℃的最佳溫度下均能進行具有活性的鏈置換反應[28]。反應的第一步是在重組酶和引物之間形成復合物，該復合物與雙鏈DNA中同源序列的互補DNA結合。一旦引物與同源序列結合，就會發生鏈交換反應，啟動DNA合成，并以指數方式擴增模板上的靶區域，取代的DNA鏈與SSB結合以防止進一步取代[29]。在該系統中，合成反應由兩個相對的引物引發，整個過程在10 min內獲得可檢出水平的擴增產物。這種方法由于反應溫度相對較低，不會出現液體蒸發的問題。

CHOI G等[30]，研發出集成性的離心式芯片及配套檢測儀器。能夠在單個離心式芯片中進行牛奶細菌的裂解，試劑的精準分裝，RPA擴增以及實時熒光檢測。單個離心式芯片包含一式三份相同功能單元，每個單元含有四個反應腔；每部分芯片由兩層組成，包括RPA試劑注入頂層和含有食源性致病菌的加標牛奶樣品裝入底層。芯片的操作流程如圖2A所示：首先將細菌樣品添加到芯片的樣品入口(a)，RPA試劑添加至試劑入口(b)，通過800 r/min轉速使細菌樣品進入等分腔(c)將樣品等分為四份，再調節至3 000 r/min轉速，頂層的RPA試劑通過微通道流入至緩沖液腔(d)。最終以5 000 r/min的速度將等分腔(c) 中的細菌樣品和緩沖液腔(d)的RPA試劑同時加載到每個反應腔(e)中混合，再進行RPA擴增后續檢測。此方法可以在39 ℃恒溫30 min，通過熒光變化同時檢測牛奶樣品中三種食源致病菌，并且可直接對樣品進行檢測無需提取DNA。

CHEN J等[31]，研發出一種便攜式過濾移液器，可從尿液樣本中檢測出五種不同的致病菌。芯片的操作流程如圖2B所示：首先將磁力攪拌子與氧化鋯珠預封裝于芯片裂解腔(b)內，通過芯片的入口(a)將細菌懸浮液添加到裂解腔(b)，RPA混合溶液添加至儲存腔(c)中，并將所有的進出口都用膠帶密封。隨后把芯片放在定制的磁力攪拌器上，用芯片磁珠裂解法將細菌裂解。其次RPA混合物以100 r/min的轉速流動到第一個虹吸閥(Ⅰ)，再將細菌裂解物以3 000 r/min流動到定量室(d)中。將轉速降低至50 r/min， RPA混合溶液流動到第二個虹吸閥(Ⅱ)中，同時裂解物也流動至虹吸閥(Ⅲ)中，同時進入混合腔(e)。調節轉速500 r/min至4 000 r/min使細菌裂解物與RPA混合液在混合腔進行混合。最終調節1 000 r/min的轉速使溶液在等分腔(f)中等分，再以4 000 r/min的轉速分配到各反應腔室(g)中進行實時RPA擴增及熒光檢測。此方法能夠在39 ℃下反應30 min從尿液樣品中成功檢測到大腸桿菌，變形桿菌，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

(A) 食源性致病菌的檢測[30]

(B) 致病菌的檢測[31]

(C) 單病原菌檢測[35]

(D) 病原菌的檢測[36]圖2 離心式芯片與等溫擴增相結合

KIM T H等[32]研發出一種離心微流控驅動檢測設備。在等溫擴增步驟中，可以通過單個激光二極管用于閥門驅動、細胞裂解和非接觸無線控制的加熱功能，研發出緊湊而小型的系統。其能夠將DNA提取、等溫重組酶聚合酶擴增和檢測的三個主要步驟一體化，可用于微量沙門氏菌核酸分析系統。

離心式微流體平臺與RPA結合使用時，RPA具有高靈敏度，故需要對于不同基因的引物和探針序列進一步優化防止非特異性產物擴增或檢測樣品被污染。由于離心式芯片添加樣品及檢測樣品的量均很小，需要考慮到擴增、檢測方法的可行性及重復性。

2.2 環介導等溫擴增(LAMP)

環介導等溫擴增(LAMP)使用一對設計的引物(前向和后向內引物)來生成兩端都帶有環的模板，借助前向和后向外部引物，使該雙端環狀模板將靶DNA序列置換。通過使用前向和后向內部引物復制并延長兩端環狀模板，將其用于下游擴增[33]。由于復制和延伸可以同時進行，DNA擴增的速度增加。反應使用四種引物和具有高抑制劑耐受性的Bst DNA聚合酶，僅需在60 min內，60 ℃至70 ℃恒定溫度范圍內下發生反應[34]，可顯著提高了擴增效率和特異性。

LOO J F C等[35]研究出集成的離心式核酸等溫擴增芯片，包括DNA提取、LAMP反應和實時熒光檢測。其設計創新點在于使用微球油脂被動閥來控制流體的存儲和釋放。芯片的操作流程如圖2C所示：首先將微球、硅膠膜及蛋白酶K預存儲于芯片中(a)及加熱部分(g)，依次在進樣腔(b)、結合液添加腔(c)、洗滌液添加腔(d)、洗脫液添加腔(e)、LAMP反應添加液腔室(f)加入對應溶液，每個腔室均使用各種具有不同開啟壓力的微球油脂閥。其次調節300 r/min的轉速釋放樣品到(g)，與預存儲的蛋白酶K混合并加熱到56 ℃，實現細菌裂解。轉速增加至600 r/min，使結合液釋放到(g)與裂解樣品混合，并流動至硅膠膜，DNA與硅膠膜結合；轉速增加至900 r/min，釋放洗滌液洗滌純化在二氧化硅上的DNA；轉速增加至1 200 r/min釋放洗脫液，將DNA從硅膠膜洗脫；最后，轉速增加至1 500 r/min，使純化的DNA流動到LAMP反應位點(f)，同時將LAMP反應物與DNA進行混合，在反應腔(f)進行LAMP擴增及后續檢測反應，其他緩沖液進入廢液腔(h)。此芯片能夠在2 h內檢測到痰液和血液中結核分枝桿菌和鮑曼不動桿菌且最小檢測線為103和102CFU。但此方法的檢測平臺在通量方面具有局限性，運行一次只能檢測一種樣品的一種目標細菌，并且微球和油脂被動閥的穩定性較差，需要在實驗中最大程度地減少油脂對分子診斷影響。

SAYAD A等[36]開發了適用于單病原體檢測的離心式芯片，此芯片將LAMP與自動無線終點檢測系統相結合。該離心式芯片設計包含一式六份的相同的功能單元，每個單元含有五個反應腔對三種不同食源性病原體檢測。芯片的操作流程如圖2D所示：首先將蠟及密封材料(如石蠟油)分別注入蠟閥及密封材料腔(e)，并將DNA樣品及引物分別加入(a)的進樣腔和緩沖液腔；以400 r/min的轉速將樣品與緩沖液通過微通道至混合腔中(b)進行混合，再以600 r/min的轉速將混合好的試劑進入等分腔(c)等分，過量的液體進入廢液腔(d)。最終調節1 200 r/min轉速將液體轉移至反應腔進行LAMP反應。由于LAMP反應可能產生氣溶膠污染，因此采用融化蠟閥使密封材料腔(e)中液體流出，密封LAMP反應環境。此芯片使用鈣黃綠素比色法檢測，僅需60 ℃下反應60 min便能通過藍牙無線技術將檢測結果傳輸至智能手機，該檢測方法的最低檢測限為3×10-5ng/μL。

ZHANG L等[37]報告了一種手動離心操控的離心式芯片，通過手工拉動一組嚙合齒輪實現芯片的離心旋轉。此芯片將核酸純化與LAMP方法整合在一起，該芯片分為四層，包含一式八份的相同的檢測單元，每個檢測單元由四個檢測腔組成。此芯片采用將沸石預存儲于芯片內方便核酸純化，再設計毛細管閥控制樣品與各腔室的連接，最終通過離心速度的調節逐級流動。手動離心機可將樣品通過不同離心力旋轉進入檢測腔，使用無電方式同時檢測六種病原體。

離心式芯片與LAMP結合可有效實現集成化，小型化檢測，LAMP方法可在一個離心式芯片上實現多目標檢測，此設計將具有重大價值，擁有很高的應用前景。但LAMP引物多且設計復雜，需要進一步的研究來改善引物特異性，并且其擴增產物是一條長DNA鏈，不適合鑒定目標核酸的其他分子，且通用性較PCR低。

2.3 依賴核酸序列擴增(NASBA)

依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一種以單鏈 RNA為模板，在恒溫條件下，通過逆轉錄酶、RNase H、T7 RNA聚合酶、正向引物和反向引物來模擬體內逆轉錄病毒的復制機制，對目標RNA進行擴增，90 min內可以將靶標擴增至1012，其產物長度為100 bp～250 bp，靈敏度可達檢測單個拷貝的靶標分子[38]，通過調整NASBA擴增程序可以用于DNA的檢測，但需要反復開管加入不同階段所需要的組分[39]。

DEIMAN B等[40]提出了使用非接觸加熱和熒光檢測技術來實現核酸體外擴增的離心式芯片。通過實施基于核酸序列的擴增(NASBA)反應，對流感嗜血桿菌的tmRNA轉錄，證明了離心式芯片功能。該系統實施非接觸式紅外加熱，在變性和擴增步驟中將NASBA反應加熱至所需的目標溫度。該控制系統使用磁場進行腔室定位，在所需位置進行加熱和熒光檢測。流感嗜血桿菌tmRNA在系統上執行的NASBA測定范圍為102～104個。

由于NASBA反應需要兩個不同的溫度，RNA二級結構的變性需要65 ℃，反應孵育需要41 ℃，因此RPA反應(37 ℃～42 ℃)和LAMP反應(60 ℃～65 ℃)更常應用于離心式芯片。且此方法擴增步驟多，反應體系較復雜，需要多次添加緩沖不易開發集成性離心式檢測芯片。

3 總結及展望

離心微流控芯片不需要其它外部連接，能夠降低了樣品檢測過程中出現交叉污染的風險，有效避免了處理生物危害性樣品的危險，避免了擴增后產物釋放有毒有害物質等情況。因為離心微流控檢測儀體積小，方便攜帶，檢測時間短，測量精準等優勢，已經研究出在食品、醫療、環境等方面的離心式芯片。將離心微流控技術與核酸等溫擴增相結合，為現場短時間核酸檢測提供可能。

為了實現離心微流控技術在核酸等溫擴增一體化系統集成應用，還需要一些改進研究。第一， 在離心式芯片樣品制備中，最新技術僅允許從少量、簡單的樣品中提取核酸，但不能處理更復雜的樣品(組織等)，因此，在芯片上處理復雜的樣品仍是一個緊迫的問題；第二，在檢測過程中，許多步驟仍需手動進行樣品及緩沖液的添加，且對于部分液體試劑，缺乏芯片上長期穩定有效的預存儲方法；第三，目前離心式芯片制作需要微通道，預存儲，閥門設計，珠粒填充等步驟，需要高緊密度和準確性，難以確保產業化的可重復性；第四，離心式芯片的自動化程度還不高，應開發相應檢測程序軟件幫助進一步實現更便捷、快速、準確的測試結果。

未來微流控技術用于核酸檢測的發展趨勢在于：核酸檢測人員不需要經過仔細的樣品收集和專門操作基本儀器的培訓，便能夠準確檢測出結果；規模化制造具有低成本、高質量的商業離心式芯片檢測產品，自動化完成一系列測試反應，后期能夠輕松進行數據分析，報告，保存和導出的集成性產品。