SOCS1基因沉默增強DC疫苗應用于肺癌動物模型中的效果研究

曹瑞萍 王策

【摘要】目的探究SOCSI基因沉默增強DC疫苗應用于肺癌動物模型中的效果。方法選取SPF'級的雌性近交鼠系，均進行細胞培養、荷瘤動物的建模與治療。觀察轉染siRNA抑制SOCSl表達情況、DC疫苗抑制腫瘤生長情況、DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力。結果經熒光顯微鏡下觀察大部分細胞呈現綠色，證明轉染siRNA抑制了socsi表達。經治療后，自14 d開始，lvsate-mDC和lvsat elsiRNA-mDC腫瘤生長緩慢，PBS生長依然迅速。DC沉默SOCS1后對TCL的特異性殺傷效果更好，未沉默時對其殺傷效果不好。結論研究發現沉默后的DC對肺癌患者治療效果更優，在臨床腫瘤治療的應用性很廣。

【關鍵詞】SOCS1基因;DC疫苗;肺癌動物模型

DOI： 10.14163/j.cnki.ll-5547/r.2020.19.095

最新的調查數據顯示，由于吸煙等有害習慣以及其他不可控因素近年來肺癌的發病人數直線上升，這種腫瘤的死亡率很高，甚至在所有惡性腫瘤中位居首位。但是對于癌癥的治療仍舊是一大難題，微小的病灶通過手術的方式很難清除，而小細胞肺癌患者不能耐受化療，因此DC生物疫苗的治療就受到了眾多關注。DC是通過將腫瘤細胞荷載，然后激活T淋巴細胞的免疫功能，使其清除腫瘤細胞[1]。DC治療比手術安全性更高，且并發癥副作用情況相對少。但是在應用中發現，DC激發出的免疫性能非常有效，不能快速清除腫瘤細胞，因此治療情況一般[2]。因為腫瘤細胞也會靈活躲避免疫系統的攻擊，有很多逃逸機制。因此需要采取其他方法對原有的DC進行改良修飾，提高抗原提呈能力，提高激發的免疫功能應答能力。因此，本文通過肺癌動物模型的案例，對DC進行SOCSI沉默，觀察對比沉默之前與沉默之后的治療效果，為臨床肺癌治療提供指導依據。

l材料與方法

1.1材料

1.1.1制備細胞株及腫瘤裂解物肺癌細胞株購白美國模式培養物集存庫，將肺癌細胞株放培養在含有10%的FCS、濃度為10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸、濃度為每毫升酶活為100的青霉素和100 ug/ml的鏈霉素（利君制藥）的RPMI1640完全培養基中。等到肺癌細胞株占據瓶底的4/5時，將其鏟下再經過三次磷酸緩沖鹽溶液洗滌，在-80℃冷凍然后在37℃溶解這個過程重復5次，裂解方法采用超聲波，最后經離心機離心然后對上清收集即可。

1.1.2實驗動物 由于對致癌物近交鼠系有很高的敏感性，因此本實驗選取SPF級的雌性近交鼠系，實驗小鼠的周齡為3-6周，從中科院上海生物科學研究院購買，數量共36只。

1.2方法

1.2.1細胞培養首先獲取小鼠的骨髓細胞在去除紅細胞后經過5-7 d的培養后，將培養板中的懸浮和松散貼壁的細胞取出，這些細胞是極為不成熟的DC細胞。用lvsate-mDC和lvsate/siRNA-mDC分別標記未沉默SOCS1的iDC和沉默SOCSI的iDC，最后檢驗其純度。

1.2.2荷瘤動物的建模與治療將滅菌50ug的滅菌PBS、lysate-mDC（I×106細胞/50 ul）、lvaste/siRNA-mDC（lx 106細胞/50 ul）在小鼠接種腫瘤的14 d注射至小鼠的足墊皮下，要想使DC充分成熟，在接種疫苗后的3d內對每只小鼠每天注射30 ug/200 uI的LPS。在當天用洗滌重選后的PBS以每細胞/5×lO-4在小鼠腋窩皮下接種。從第8天開始，每2d用游標卡尺測量1次小鼠的腫瘤體積。在接種后的第18天殺死小鼠取其脾細胞分別培養后分別檢測LDH的吸光度、斑點數、干擾素-r（IFN-r）等。

1.3觀察指標觀察轉染siRNA抑制SOCS1表達情況、DC疫苗抑制腫瘤生長情況、DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力。顯微鏡下DC顏色：因為直觀觀察轉染的效果，用熒光染料標記siRNA，若轉入DC則呈現綠色。

2結果

2.1轉染siRNA抑制SOCS1表達情況 經熒光顯微鏡下觀察大部分細胞呈現綠色，證明轉染siRNA抑制了SOCSI表達。

2.2 DC疫苗抑制腫瘤生長情況經治療后，白14 d開始，lvsate-mDC和Ivsate/siRNA-mDC腫瘤生長緩慢，PBS生長依然迅速。見表1。

2.3 DC疫苗對腫瘤的特異殺傷能力DC沉默SOCSI后對TCL的特異性殺傷效果更好，未沉默時對其殺傷效果不好。

3討論

RNAis是近年來生理學以及生物學領域的一大發現，對于它的原理可以這樣解析，在它與mRNA重組結合以后，進而使其降解，達到對基因的轉錄并沉默的效果[3]。這一原理的提出為生理學的發展進步起到重大推動作用，通過這個理論解析使我們更加清楚基因信息控制的基本原理，在生物學中的地位也是不容忽視的，為許多疑惑進行一定程度的解答[4]。這項原理理論的特異以及撼動價值使其在各個領域的應用廣泛，在醫學中的理論指導也有很多涉及。對于DC腫瘤疫苗的預備性研究也采取了該理論的應用技術[5]。

研究過程中發現一個有趣的現象，當siRNA沉默在SOCSI調節分子后，能夠提高刺激之后的共刺激分子的表達能力。進而能夠提高抗原輸出性能以及使成熟度進一步提升[6]。其他研究者也發現了類似的情況。研究者對Dil h+單核細胞進行了觀察研究，研究人員發現，LPS原本是來自于細菌中細胞壁結構中的成分，它的配體是一種叫做Toll-樣受體4（TLR4）的受體[7]，如果對SOCSI的運動進行抑制阻礙，單核細胞以及DC對LPS的反應活性也會相應升高[8]。這一研究說明，SOCSI對于很多通路的調節過程起著非常重要的作用[9]，無論是JAK/STAT還是TLR4參與的通路，SOCSI的參與性不可忽視[10]。

本研究對小鼠進行了肺癌動物模型的模擬實驗，在對小鼠攝入疫苗治療之后，可以得到一個結論，在SOCSI沒有進行沉默的小鼠治療之后發現疫苗的效果也有一定成效，但是SOCSI沉默之后的疫苗對于小鼠的治療效果更為顯著。沉默之后的腫瘤細胞的生長繁殖受抑制明顯，CD4+對于體外腫瘤細的清除扼殺力度增強，這個過程分泌產生的免疫性細胞因子增多。結果表明，SOCSI是對于疫苗的功能反饋控制的重要因素，沉默SOCSI能夠提高患者的免疫能力，對于DC功能是強化作用。對于未來DC疫苗的臨床應用治療，SOCSI的作用可以進一步利用，醫學應用性非常顯著，對于肺癌患者的治療也是非常有效的改良手段，為患者帶來希望。