應用16S rDNA分析撒壩火腿表面和內部微生物多樣性

張雅靖 舒相華 黃鑫 呂濤 王余磊 張雅倫 張智慧 羅高 李鑫漢 李向楠 宋春蓮

摘 要：為分析云南撒壩火腿中微生物的菌群構成、物種豐富度和多樣性差異，以1 年以上的撒壩火腿為研究對象，通過提取DNA，采用Illumina高通量測序方法對火腿表面和內部細菌的16S rDNA V3～V4區和真菌ITS2區進行擴增和測序，并對其菌落構成和多樣性進行分析。結果表明：撒壩火腿中微生物菌群存在差異，細菌豐富度極顯著高于真菌（P<0.01），多樣性高于真菌，且內部真菌和細菌微生物多樣性和豐富度均高于表面;子囊菌門下曲霉菌屬是表面和內部真菌中的優勢菌群，其次Yamadazyma和青霉菌屬也是主要菌群，這些菌屬在火腿表面的分布多于內部;厚壁菌門下葡萄球菌屬是火腿表面和內部細菌中的優勢菌群，色鹽桿菌、酸桿菌和鏈球菌也是表面的主要菌群;放線菌、桿菌屬、酸微菌綱及球菌屬則是火腿內部的主要菌群，此外火腿內部還存在大量未知微生物。綜上所述，曲霉菌和葡萄球菌是撒壩火腿表面和內部的優勢菌群。

關鍵詞：撒壩火腿;微生物多樣性;高通量測序;16S rDNA

Abstract： In order to analyze the microbial flora composition， species richness and diversity of Saba ham， a traditional Chinese fermented meat product in Yunnan province， total microbial DNA was extracted from Saba ham （more than one year old） for amplification and Illumina high-throughput sequencing of the V3-V4 region of the bacterial 16S rDNA gene and the ITS2 region of the fungal ITS rDNA gene on the surface and in the interior of Saba ham. Further， the microbiota composition and diversity were analyzed. The results revealed that the microbial flora in the ham varied; the diversity and abundance of bacteria were significantly higher than those of fungi （P < 0.01）， and the diversity and abundance of fungi and bacteria in the interior were higher than those on the surface （P < 0.05）. Aspergillus， a genus in the phylum Ascomycota， was the dominant fungus both on the surface and in the interior， followed by Yamadazyma and Penicillium， which were more distributed on the surface than in the interior. At the bacterial genus level， Staphylococcus， belonging to Firmicutess was dominant both on the surface and in the interior; Chromohalobacter， Mitsuokella and Streptococcus were also dominant on the surface， and Actinobacteria， Bacillus， Acidimicrobiia and Coccus were also dominant in the interior. In addition， there were a large number of unknown and unclassified microorganisms in the interior. Collectively， the above results demonstrated that Aspergillus and Staphylococcus were the dominant microbes both on the surface and in the interior of Saba ham.

Keywords： Saba ham; microbial diversity; high-throughput sequencing; 16S rDNA

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200803-184

中圖分類號：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0026-07

撒壩火腿主產于云南省昆明市祿勸縣馬鹿塘鄉，馬鹿塘海拔2 750 米，常年平均氣溫10.4 ℃，屬于冷涼高寒山區[1]。當地農民采用本地撒壩豬的后腿，修割成琵琶形狀，進行低溫冷涼、排血，再將配制好的鹽料分3 次上鹽、堆碼、清表面，掛于通風陰涼處，在微生物協助下經過長達12 個月或以上的自然熟化，成熟后的火腿具有特殊香味且有玫瑰紅色切面，是人們佐食的佳肴。近年來由于撒壩豬種稀缺，養殖規模急劇下降，致使撒壩火腿產業出現生產技術創新滯后、質量下降等問題[2]。

在火腿成熟過程中微生物對風味的形成和品質起著重要作用[3]。在沒有內源性酶的情況下，微生物可以降解火腿中的蛋白質;另外微生物的群落組成和消長受氣候及地域的影響，從而促進火腿品質特征的形成，如云南的宣威火腿、諾鄧火腿、鶴慶圓腿、三川火腿和老窩火腿等[4]。宣威火腿獨特風味形成的基礎與葡萄球菌、微球菌的代謝活動和火腿表面霉菌的生長有關[5]。胡永金等[6]研究發現，三川火腿的優勢菌為馬尾葡萄球菌和模仿葡萄球菌。張詩意等[7]從貴州威寧火腿中分離得到馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、乳酸片球菌、變平滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌。Alapont等[8]研究表明，青霉屬、產黃青霉屬、納爾青霉菌屬和枝孢枝霉屬等菌株可作為西班牙特魯火腿的發酵劑。

云南傳統發酵肉制品中微生物的測定大多采用經典的分離培養和菌落鑒定方法，或是分離后在顯微鏡下直接進行形態觀察，但是這些方法僅能檢測出完整微生物種群的一部分，限制了人們對微生物的認識及利用[9]。近年來，16S rDNA分子生物學技術促進了微生態研究的發展。16S rDNA測序比傳統方法具有更高的檢測效率，因此在未培養細菌的分類中得到廣泛應用[10]。此外，16S rDNA測序技術相對便宜，并且有一套用于數據分析的完善計算工具及數據庫，而且16S rDNA基因存在于所有細菌物種中[11]，因此被認為是研究細菌多樣性的理想方法[12]。郭明亮[13]采用Illumina Miseq高通量測序方法對4 個月和2 年的金華火腿與成品宣威火腿的16S rDNA V3區進行研究，結果表明，葡萄球菌和乳酸菌是主要菌群。黨喜軍[14]采用純培養和16S/內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）測序對諾鄧火腿表面微生物進行研究，結果表明，酵母菌、曲霉菌和葡萄球菌是主要優勢菌群。

目前關于撒壩火腿中微生物方面的系統研究還很少，與其他火腿的微生物構成是否相似尚不清楚。基于此，本研究對云南撒壩火腿表面和內部微生物的菌群構相、微生物的豐富程度及多樣性進行系統分析，旨在為云南開發利用撒壩火腿微生物、發展火腿文化產業提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

撒壩火腿采購自云南省昆明市祿勸縣馬鹿塘鄉當地農戶，為腌制1 年以上的火腿，共3 只。土壤（HiPure Soil）DNA提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司;AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司;TruSeqTM DNA樣品制備試劑盒 美國Illumina公司;10×KOD（Kodakara品牌）緩沖液、KOD DNA聚合酶 日本Toyobo生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

NanoPhotometer NP80超微量分光光度計 德國Implen公司;-80 ℃冰箱 合肥美菱股份有限公司;DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠;聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國耶拿公司;WD-9413B凝膠成像分析系統 北京六一生物科技有限公司;Multiskan Sky全波長酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;ABI StepOnePlus實時PCR系統 美國Life Technologies公司;PE250 Illumina平臺 廣州基迪奧生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇3 只質量相近的撒壩火腿隨機編號，并作統一處理，無菌條件下每只火腿以相同的方式在半膜肌表面切厚度0.5 cm、邊長4 cm的四方形，相應編號為BM1、BM2、BM3，立即放入已滅菌的凍存管中;在內部切割厚度2 cm、邊長3 cm的肉塊，相應編號為NB1、NB2、NB3，立即放入已滅菌的凍存管中。表面和內部樣品均采集2 份，分別裝入無菌密封袋中，貯存于-80 ℃冰箱中，一份用于細菌16S rDNA測序，一份用于真菌ITS測序[15]。

1.3.2 總DNA的提取

在無菌條件下取10 g肉樣充分混勻，用HiPure Soil DNA試劑盒按操作指南提取樣品總DNA。然后用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

1.3.3 PCR擴增

經純化后的DNA用于細菌16S rDNA和真菌ITS基因擴增。以341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3）為引物對細菌V3～V4可變區進行PCR擴增[16];以ITS3-KYO2F（5-GATGAAGAACGYAGYRAA-3）和ITS4R（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）為引物對真菌ITS2區進行PCR擴增[17]。擴增程序：94 ℃、2 min，然后98 ℃、10 s，62 ℃、30 s，68 ℃、30 s進行30 個循環，最后68 ℃、5 min。擴增體系（50 μL）：5 μL 10×KOD緩沖液、5 μL 2 mmol/L dNTPs、3 μL 25 mmol/L MgSO4、上下游引物各1.5 μL（10 μmol/L）、1 μL DNA聚合酶、100 ng模板DNA。

1.3.4 Illumina測序

從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴增子，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒按操作說明進行純化，并使用ABI StepOnePlus實時PCR系統進行定量[13]。純化后的擴增子根據標準操作在Illumina平臺上進行雙端測序。

1.4 數據處理

使用Omicsmart動態實時數據分析平臺（http：//www.omicsmart.com）進行數據分析。利用FASTP軟件（版本0.18.0）對原始測序數據進行過濾，使用QIIME軟件（版本1.9.1）進行序列拼接。參考數據庫（http：//drive5.com/uchime/uchime_download.html），使用UCHIME算法[18]進行tag嵌合體檢查進行后續分析。使用UPARSE（版本9.2.64）流程將Clean Tag按≥97%相似度聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），利用RDP軟件（版本2.2）進行物種分類注釋，比對SILVA數據庫[19]和ITS2數據庫[20]。使用R語言進行多元統計分析。使用QIIME軟件計算α多樣性指數。使用Graphpad Prism軟件（版本8.0.1）進行雙因素方差分析，判定表面和內部真菌與細菌的差異，P<0.05被認為有統計學差異，判斷為差異顯著;P<0.01判斷為差異極顯著。

微生物菌群在干腌火腿加工過程中起著極其重要的作用。大量研究表明，霉菌、酵母菌、葡萄球菌、微球菌和乳酸菌等是干腌火腿的優勢微生物[23]。黃占旺等[24]發現，霉菌和酵母菌是安福火腿表層的主要微生物，酵母菌和球菌則是內部的主要微生物。Battilani等[25]從意大利Parma火腿表面檢測出曲霉菌和青霉菌，青霉菌占大多數，其中納地青霉占青霉屬總量的60%。在本研究中，曲霉菌是撒壩火腿表面和內部真菌中的優勢菌群，Yamadazyma和青霉菌也是表面的主要菌群。曲霉菌在我國金華火腿、諾鄧火腿和盤縣火腿及意大利San Daniele火腿中同樣為優勢真菌[14，22，26-27]，具有隔絕空氣、抑制有害菌生長等多種功能[28]。Cebrián等[29]研究表明，青霉菌和酵母菌聯合使用能防治干腌火腿黃曲霉素的危害。葡萄球菌是撒壩火腿表面和內部細菌中的優勢菌群，但內部存在許多未知的微生物。其次，酸桿菌和鏈球菌是撒壩火腿表面微生物的主要差異菌群，放線菌屬、桿菌屬、酸微菌綱及球菌屬則是內部的主要差異菌群。其中，葡萄球菌屬在我國宣威火腿、劍門火腿和三川火腿及西班牙火腿中同樣為優勢菌群[6，13，30-31]，具有較高的蛋白酶和脂肪酶活性，在維持火腿顏色、品質和抑制不良氣味產生方面起著重要作用[32]。Mu Yu等[33]研究表明，葡萄球菌屬、嗜色桿菌屬、曲霉屬和青霉菌屬等對盤縣火腿的感官品質和安全性至關重要。說明不同工藝和環境會導致不同火腿中的優勢微生物不盡相同，這也促使不同種類火腿品質各具特色。

4 結 論

本研究對云南撒壩火腿表面和內部微生物多樣性進行分析，結果表明，微生物菌群種類存在差異，細菌多樣性和豐富度高于真菌，內部的微生物組成相比表面較為豐富，曲霉菌和葡萄球菌是表面和內部的優勢菌群。本研究結果為撒壩火腿的風味結構、發酵菌群的變化、病原菌的存在及微生物安全性提供了理論依據。

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