超高效液相色譜-熒光檢測法測定禽肉組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量

吳蓉 朱曉軍 周瑋 李潔莉 傅嘉星

摘 要：建立超高效液相色譜-熒光檢測法測定禽肉組織中乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP）殘留量的分析方法。樣品用乙腈提取，采用C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），乙腈-水（30∶70，V/V）為流動相，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5.0 μL，采用熒光檢測器，在激發波長272 nm、發射波長394 nm條件下測定。結果表明：ETP在5～500 ng/mL質量濃度范圍內呈良好的線性關系（R2=0.999 7）;檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg;平均回收率為83.0%～91.5%，相對標準偏差為1.6%～2.9%。本方法適用于檢測禽肉組織中ETP殘留量。

關鍵詞：超高效液相色譜法;禽肉組織;乙氧酰胺苯甲酯;熒光檢測器

Abstract： An analytical method for the determination of ethopabate residues in poultry muscle tissues was established using ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence detection （UPLC-FLD）. Samples were extracted with acetonitrile and separated on a C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm） using a mobile phase consisting of acetonitrile and water （30：70， V/V） at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature and injection volume were set as 30 ℃ and 5.0 μL， respectively. The eluate was detected using a fluorescence detector at an excitation wavelength of 272 nm and an emission wavelength of 394 nm. The results showed that good linearity was observed in the concentration range of 5–500 ng/mL?（R2 = 0.999 7）. The limit of detection was 2 μg/kg， and the limit of quantitation was 5 μg/kg. The average recoveries of spiked samples were 83.0%–91.5% with relative standard deviation （RSD） of 1.6% to 2.9%. The method proved to be applicable for the determination of ethopabate residues in poultry muscle tissues.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; poultry muscle tissue; ethopabate; fluorescence detector

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200811-196

中圖分類號：O657.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0053-05

乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP），又名4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯（結構式見圖1），分子式為C12H15O4N，是一種廣譜抗球蟲增效劑[1-2]，常被添加在家禽飼料中，與其他抗球蟲藥物配伍使用，可以降低抗藥性，提高藥效[3-5]，因此，被廣泛用于預防和治療球蟲病[6]。

ETP在養殖行業長期大量使用后易在動物肌肉、肝、腎和蛋中殘留[7-8]，對消費者健康構成潛在威脅[9-10]，我國現行標準GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[11]規定，ETP在雞肉中最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為500 μg/kg，在雞肝和雞腎中MRL為1 500 μg/kg，但并未規定ETP在其他禽肉組織中的MRL。因此，探討并建立禽肉組織中ETP殘留量的檢測方法有利于加強養殖行業的監管機制。

目前，我國現實施標準GB 31660.9—2019《食品安全國家標準 家禽可食性組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量的測定 高效液相色譜法》[12]規定了家禽可食性組織中ETP殘留量的檢測方法，但該方法前處理繁瑣，耗時費力，不適合樣品高通量分析。國內外文獻報道檢測禽肉組織中ETP殘留量的方法主要有高效液相色譜-紫外檢測法[13-15]、液相色譜-質譜法[16-21]和熒光分光光度法[22-23]等。高效液相色譜-紫外檢測法重現性好、準確度高，但前處理需要使用固相萃取柱凈化[24-25]，成本較高，靈敏度較低，且儀器分析時間較長;液相色譜-質譜法因其靈敏度高、選擇性強被廣泛應用于獸藥殘留分析[26-28]，但該法前處理繁瑣、耗時且儀器成本較高，更適用于多殘留測定;熒光分光光度法靈敏度高，但選擇性較差。

本研究以已報道文獻[18，24-25]為基礎，優化前處理條件，采用乙腈進行提取，利用熒光檢測器的強選擇性和高靈敏度特點，對雞、鴨、鵝肌肉組織中ETP殘留量進行分析，建立禽肉組織中ETP殘留量測定的超高效液相色譜-熒光檢測法，國內外鮮見相關報道，為禽肉組織中ETP殘留量的準確測定和安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市售雞、鴨、鵝肌肉組織。無水硫酸鈉（分析純）、丙酮（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 德國默克股份兩合公司;正己烷（色譜純） 永華化學科技（江蘇）有限公司;水均為超純水;ETP（純度≥98.83%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀、1260熒光檢測器、1290 InfinityⅡ FS二極管陣列檢測器 美國Agilent公司;PL2002電子天平 美國梅特勒-托利多儀器公司;SB-4200DTS超聲波雙頻清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Avanti JXN-26離心機 美國Beckman Coulter公司;R-205旋轉蒸發儀 瑞士Buchi Manschette公司;硅酸鎂固相萃取柱（1 g/6 mL） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取適量ETP標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液。

標準工作液：吸取不同體積的標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成質量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取新鮮或解凍后的絞碎勻漿試樣5.0 g于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL乙腈和5 g無水硫酸鈉，渦旋混勻1 min，振蕩5 min，4 000 r/min低溫離心5 min，收集提取液于離心管，殘渣用10 mL乙腈按照上述步驟重復提取1 次，合并2 次提取液，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩混勻后離心分層，取乙腈層60 ℃旋蒸至干，加入2.5 mL甲醇溶解（樣品中目標物含量較高時，可用甲醇稀釋樣液），經0.22 μm濾膜過濾后作為待測液供超高效液相色譜儀分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流動相：乙腈、水體積比30∶70;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量5.0 μL;熒光檢測器;激發波長272 nm;發射波長394 nm。

1.3.4 結果計算

樣品中目標物含量按下式計算。

式中：X為樣品中目標物含量/（μg/kg）;ρ為測試溶液中目標物質量濃度/（ng/mL）（由儀器工作站軟件直接計算得出）;V為試樣實際稀釋液總體積（2.5 mL）;m為樣品質量/g。

1.4 數據處理

超高效液相色譜圖采用Agilent OpenLAB CDS-Acquisition軟件進行采集，使用Agilent OpenLab Analysis軟件對實驗數據進行統計分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 前處理方法參數選擇

2.1.1 前處理方式的選擇

采用高效液相色譜法測定ETP含量時多采用硅酸鎂固相萃取柱。固相萃取的選擇性吸附和洗脫可以對樣品進行富集、分離及凈化，采用固相萃取柱能有效去除干擾雜質，因此，常應用于實驗室的樣品前處理步驟。以雞肌肉組織為空白基質，添加50 μg/kg ETP標準品，以乙腈為提取試劑，按照1.3.2節進行樣品前處理。與采用硅酸鎂固相萃取柱的樣品前處理方法進行對比分析，比較2 種前處理方式對ETP回收率的影響。

由圖2可知，2 種前處理方式均能有效分離目標物，無明顯雜峰干擾，但選用本研究方法處理，目標物峰面積較大，回收率更高。因此，選用本研究中前處理方法不僅簡便、快速、節約成本，且回收率高、無明顯雜峰干擾。

2.1.2 旋蒸溫度的選擇

以雞肌肉組織為空白基質，添加100 μg/kg ETP標準品，以乙腈為提取試劑，對比分析不同旋蒸溫度對ETP測定結果的影響。由圖3可知，旋蒸溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時，旋蒸溫度對ETP回收率幾乎沒有影響，因此，選擇60 ℃為本方法的最佳旋蒸溫度，不僅可以縮短前處理時間，還可以提高檢測效率。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測器的選擇

目前，現有液相色譜法測定ETP殘留量的檢測器有紫外檢測器和熒光檢測器，紫外檢測器適用性廣，但靈敏度低，雜質峰干擾多且基線不平穩，而熒光檢測器的高靈敏度和強選擇性彌補了紫外檢測器的不足。由圖4可知，在激發波長272 nm、發射波長349 nm條件下，采用熒光檢測器測定ETP殘留量的響應強度是紫外檢測器的近10 倍，因此，本研究選用熒光檢測器測定禽肉組織中ETP殘留量。

2.2.2 檢測波長的選擇

激發波長和發射波長是熒光檢測的必要參數，通過儀器軟件參數設置，獲取目標物的最優激發波長和發射波長，可以很大程度地提高檢測靈敏度。由圖5可知，本方法的最佳熒光檢測條件為激發波長272 nm，發射波長349 nm。

2.3 線性方程、方法檢出限和定量限

采用外標法對ETP進行定量分析，按1.3.3節色譜條件，以標準品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標計算回歸方程和相關系數，得到回歸方程為y=0.109 5x+0.091 3（R2=0.999 7），該方法在質量濃度5～500 ng/mL范圍內線性良好，滿足定量分析要求。

在最優實驗條件下，向空白基質樣品中添加ETP標準溶液，按1.3節實驗方法測定，以測定結果的3 倍信噪比（RS/N≥3）為檢出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比（RS/N≥10）為定量限（limit of quantification，LOQ），計算可得，方法LOD為2 μg/kg，LOQ為5 μg/kg。我國現行標準GB 31660.9—2019《食品安全國家標準 家禽可食性組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量的測定 高效液相色譜法》[12]中規定，禽肌肉組織中ETP的LOD為20 μg/kg，LOQ為50 μg/kg，均大于本研究測定值，因此，本方法具備更靈敏的定量檢測能力，滿足禽肉組織中ETP殘留量的分析要求。

2.4 方法準確度和精密度

為考察本方法的準確度和精密度，選擇不同基質樣品（雞肉、鴨肉、鵝肉），以5、50、500 μg/kg（方法LOQ、選一合適點、國標最高殘留限量）3 個水平將ETP添加到陰性基質樣品中，每組6 個平行。

由表1可知，各基質樣品中ETP平均回收率為83.0%～91.5%，相對標準偏差為1.6%～2.9%，表明該法準確度高、精密度好，能滿足獸藥殘留[29]定量分析要求和實驗室質控[30]要求。

3 結 論

建立超高效液相色譜-熒光檢測法測定肉類食品中ETP殘留量。綜合現有分析方法，簡化了前處理步驟，優化了儀器參數，確立了LOD和LOQ，提高了方法靈敏度和準確度。實驗結果表明，該法具有前處理操作簡單、成本低、重復性好、靈敏度和準確度高、基線平穩、雜峰干擾小等特點，解決了現有文獻報道中前處理繁瑣耗時、成本高、分析時間長等問題。本研究方法的建立有利于樣品的通量分析，提高了實驗室檢測效率，為測定肉類食品中ETP殘留量提供了可靠、準確的分析方法。

參考文獻：

[1] 李兆周， 李智麗， 陳秀金， 等. 氧化還原引發制備乙氧酰胺苯甲酯分子印跡微球及其表征[J]. 分析測試學報， 2015， 34（7）： 768-774. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.07.003.

[2] BASHA M A， ABD EL-RAHMAN M K， BEBAWY L I， et al. Validated TLC stability indicating methods for the quantitative determination of some veterinary drugs[J]. Microchemical Journal， 2019， 146： 157-163. DOI：10.1016/j.microc.2018.12.057.

[3] 田永民. 養雞生產中常用的抗球蟲藥及其使用注意事項[J]. 當代畜牧， 2019（9）： 64-65.

[4] 余永鵬. 常用抗球蟲藥及使用[J]. 廣東飼料， 2016， 25（10）： 45-47. DOI：10.3969/j.issn.1005-8613.2016.10.013.

[5] 丁佳雯， 翁亞彪， 朱建榮. 乙氧酰胺苯甲酯等藥物防治雞盲腸球蟲病的療效試驗[J]. 養禽與禽病防治， 2004（10）： 2-3.

[6] 張臘梅， 李道敏， 李兆周， 等. 乙氧酰胺苯甲酯表面分子印跡聚合物的制備與吸附特性[J]. 食品科學， 2016， 37（4）： 226-232. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201604041.

[7] 陸臻. 抗球蟲藥物在治療鴨病中的合理選用研究[J]. 當代畜牧， 2014（20）： 61-63.

[8] PIATKOWSKA M， JEDZINIAK P， ZMUDZKI J. Multiresidue method for the simultaneous determination of veterinary medicinal products， feed additives and illegal dyes in eggs using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry， 2016， 197： 571-580. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.10.076.

[9] 蘇立強， 張慧潔， 姜國強， 等. RAFT沉淀聚合法制備乙氧酰胺苯甲酯分子印跡材料及其應用[J]. 分析試驗室， 2018， 37（8）： 927-931. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2018.0179.

[10] NASR J J， SHALAN S， BELAL F. Determination of ethopabate residues in chicken muscles， liver， and eggs after aqueous SDS extraction by micellar liquid chromatography with fluorescence detection with application to baby food[J]. Food Analytical Methods， 2013， 6（6）： 1522-1528. DOI：10.1007/s12161-013-9564-1.

[11] 中華人民共和國農業農村部， 中華人民共和國國家衛生健康委員會， 國家市場監督管理總局. 食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量： GB 31650—2019[S]. 北京： 中國標準出版社， 2019.

[25] 農業部畜牧獸醫局. 動物源食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留檢測方法： 高效液相色譜法[J]. 中國獸藥雜志， 2002， 36（10）： 7-8. DOI：10.3969/j.issn.1002-1280.2002.10.004.

[26] MOLONEY M， CLARKE L， OMAHONY J， et al. Determination of 20 coccidiostats in egg and avian muscle tissue using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2012， 1253： 94-104. DOI：10.1016/j.chroma.2012.07.001.

[27] CHANG S H， LAI Y H， HUANG C N， et al. Multi-residue analysis using liquid chromatography tandem mass spectrometry for detection of 20 coccidiostats in poultry， livestock， and aquatic tissues[J]. Journal of Food and Drug Analysis， 2019， 27（3）： 703-716. DOI：10.1016/j.jfda.2019.02.004.

[28] 徐偉， 耿士偉， 劉路， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測豬肉中125 種獸藥殘留[J]. 天津農業科學， 2020， 26（2）： 50-57. DOI：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.02.012.

[29] 中國獸醫藥品監察所， 華南農業大學， 中國農業大學， 等. 獸藥殘留實驗室質量控制規范： NY/T 1896—2010[S]. 北京： 中國標準出版社， 2010.

[30] 中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局， 中國合格評定國家認可中心. 實驗室質量控制規范 食品理化檢測： GB/T 27404—2008[S]. 北京： 中國標準出版社， 2008.