基于核酸適配體的AccuBlue熒光法檢測動物食品中的恩諾沙星

劉若冰，郝怡環，楊 茜，焦文雅，王向紅

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）又名乙基環丙沙星，是目前使用較為廣泛的一種氟喹諾酮類抗生素藥物。多用于治療動物感染性疾病，不管是對革蘭氏陰性菌，還是革蘭氏陽性菌都有較好的殺滅作用[1]。在水產養殖和畜牧領域也有較為廣泛的應用，常用于治療小豬仔白、黃痢和魚類弧菌癥等疾病[2]。同樣能夠抑制如梭狀桿菌、短小芽孢桿菌、消化鏈球菌等致病菌的繁殖[3-4]。但隨著這種藥物的過量使用，動物源性食品中ENR殘留問題常有發生[5]，當在人體內蓄積到一定濃度時就會產生毒性作用[6]，可能還會導致人體過敏反應或產生其他比如過敏性哮喘[7]、頭痛[8]、惡心、嘔吐等人體不適的副作用[9]。因此，亟需建立一種快速、靈敏的食品中ENR的檢測方法。

目前用于檢測ENR的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10]、液相色譜-串聯質譜法[11]、免疫分析法[12]、毛細管電泳法[13]以及微生物法[14]等。這些方法雖具有較高的檢測靈敏度，但由于受到樣品前處理過程繁瑣、操作復雜、設備要求高等限制，使其不能廣泛地用于食品的快速檢測。核酸適配體是通過體外指數富集配體系統進化技術篩選出的能夠與無機或有機分子、蛋白等目標物發生高親和性和特異性結合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）[15]。它的獲取不依賴于生物體或細胞[16]，是獸藥殘留檢測領域的一個主要研究方向[17-19]。針對ENR的適配體檢測方法目前已有很多，趙秋伶等[20]研制了ENR酶聯適配體分析檢測試劑盒；趙銀麗等[21]建立了膠體金核酸適配體比色法；Dolati等[22]利用氧化石墨烯通過熒光共振能量轉移機制對附近熒光物質的熒光猝滅建立了一種基于核酸適配體的ENR熒光檢測方法。這些方法快速、簡單、靈敏，已經被廣泛用于開發便攜和現場使用的快速檢測。

AccuBlue是一種極為靈敏的熒光核酸染料[23]，常用于雙鏈DNA（dsDNA）的定量檢測。AccuBlue在游離狀態，或與單鏈DNA（ssDNA）共存時只發出微弱的熒光，與dsDNA共存時會與之發生結合使得熒光信號顯著增強。Duan Nuo等[24]基于AccuBlue的識別特性進行了副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測，但目前并沒有適用于小分子物質檢測的報道。

本研究基于AccuBlue對痕量dsDNA的超敏感性和ENR核酸適配體建立檢測ENR的非標記型熒光分析方法，并用于實際樣品的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、蝦肉、牛肉 市購；E N R、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、依諾沙星（enoxacin，ENX） 上海源葉科技有限公司； 牛血清蛋白（bovine serum protein，BSA） 美國Sigma公司；AccuBlue染料 美國Biotium公司；酶標抗原、ENR抗體（0.996 mg/mL）均為實驗室制備。

參照文獻[25]合成ENR的核酸適配體及其互補鏈Complementary DNA（表1）。

表1 寡核苷酸名稱與序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

1.2 儀器與設備

LUX多功能酶標儀、1500-823多功能酶標儀 美國 Thermo Scientific公司；F-750分光光度計 日本日立公司；1260液相色譜儀 安捷倫科技有限公司； SKP-02.300電熱恒溫培養箱 天津泰斯特有限公司；TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原理

AccuBlue是一種定量檢測dsDNA的染料，靈敏度較高，當它與dsDNA結合后，熒光強度會在短時間內達到峰值，熒光強度會增強1 000 倍以上，并且不與ssDNA結合。向含有核酸適配體的緩沖液體系中加入ENR，核酸適配體就會與之結合，能結合ENR的適配體空間結構就會改變，使之不能再與其互補鏈堿基互補配對。不能與ENR特異性結合的核酸適配體與反應體系中核酸適配體互補鏈雜交生成dsDNA。AccuBlue不結合單鏈核苷酸，僅識別dsDNA的螺旋溝結構，從而釋放熒光信號。結合原理如圖1所示，向相同濃度的核酸適配體體系中添加不同濃度的ENR，反應體系中的熒光強度不同，因此，可以借助熒光信號強度的變化確定樣品中ENR濃度，從而實現快速定量檢測ENR的目的[26]。

圖1 AccuBlue熒光法反應原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of AccuBlue fluorescence reaction

1.3.2 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

分別取10 μL 10 nmol/LENR 核酸適配體與Complementary DNA溶液，95 ℃加熱5 min，冰浴10 min，恢復至室溫。然后加入到96 孔黑色酶標板中混勻，25 ℃反應10 min。再加入200 μL AccuBlue熒光染料避光反應5 min，利用多功能酶標儀的熒光功能檢測熒光強度（參數設置：激發波長為468 nm，發射 波長為507 nm）。

1.3.3 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別時間的優化

將ENR核酸適配體與Complementary DNA溶液經預變性后加入反應體系，在25 ℃培養箱中分別反應5、10、15、20、25、30 min，再分別加入200 μL AccuBlue熒光染料，固定孵育時間后通過多功能酶標儀連續20 min檢測熒光強度。

1.3.4 ENR定量檢測

將0、20、50、100、500、1 000 μg/L和2 000 μg/L系列質量濃度的ENR溶液與ENR核酸適配體溶液在孔內混勻，25 ℃孵育10 min，再加入Complementary DNA溶液和AccuBlue，重復3 次檢測熒光強度。ENR藥物質量濃度為0時體系中熒光強度用F0表示。以ENR藥物質量濃度的對數為橫坐標，以F/F0為縱坐標，建立標準曲線。

1.3.5 特異性實驗

按照1.3.2節方法分別測定終質量濃度為1 000 μg/L ENR、OFL、CIP、ENX溶液體系的熒光強度，重復3 次，結果與空白對比。

1.3.6 實際樣品的檢測

稱取5.0 g脫脂奶粉溶于 10 mL的1×PBS，經14 000 r/min離心20 min，保留上清液用Tris緩沖液進行10 倍的稀釋。選取蝦肉和牛肉可食用部分剁碎混勻，準確稱取5.0 g肉樣，加入無水硫酸鈉5.0 g研磨均勻后加入提取溶劑（4 mL乙腈、0.04 mL乙酸）于3 000 r/min離心12 min，保留上清液；將殘渣重復上述操作1 次，合并上清液后氮氣吹干，再用Tris緩沖液溶稀釋20 倍[27]。然后向樣品中添加終質量濃度為200、500、1 000 μg/L的ENR標準品，經優化好的方法重復3 次測定熒光強度值，計算添加回收率。

1.3.7 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及HPLC驗證

基于抗體的ELISA方法樣品前處理為將15 g奶粉溶解于15 mL磷酸鹽緩沖溶液（1×PBS），加入5 mL三氯乙酸，5 000 r/min離心15 min，保留上清液，調節pH值為中性。準確稱取蝦肉與牛肉均質樣本1.0 g，加入5 mL 1%氨水的乙腈溶液及2.5 mL正己烷，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，棄去上層有機相，將提取液氮氣吹干，緩沖液復溶。ENR加標量分別設定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平，重復3 次測定樣品中ENR含量，計算回收率。

HPLC在參考文獻[28-30]中ENR測定方法的基礎上稍作修改，建立了奶粉、蝦肉、牛肉中ENR檢測的HPLC法。樣品處理方法為準確稱取10 g奶粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液，加入35 mL乙腈，超聲提取30 min后加入200 g/L乙酸鋅2.0 mL，乙腈定容至50 mL，10 000 r/min離心5 min，收集上清液經0.22 μmol/L有機濾膜過濾；準確稱取蝦肉與牛肉均值樣本2.00 g，分別加入12 g無水硫酸鈉和12 mL酸化乙腈，超聲提取15 min，4 500 r/min離心15 min，收集上清液移至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振蕩5 min。充分靜置后，將下層液體55 ℃旋轉蒸發至干。用1 mL流動相充分溶解殘渣，4 500 r/min離心5 min，保留上層溶液，經0.45 μm膜微孔過濾。待測樣品經HPLC儀重復3 次進行測定。HPLC分析條件為：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：0.05 mol/L的磷酸三乙胺-乙腈（pH 3）（82∶18，V/V）；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：激發波長280 nm，發射波長450 nm[31]。ENR的加標量分別設定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平。

將ELISA方法和HPLC方法測定結果與熒光法檢測結果進行比較，分析相關性。

1.4 數據統計及圖表繪制

使用Excel 2010及Origin 2017軟件進行數據統計和圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

建立基于AccuBlue熒光染料和核酸適配體方法檢測ENR的前提是確定AccuBlue與緩沖液、適配體和互補鏈之間形成的雙鏈核苷酸反應后是否釋放熒光，該熒光信號是否可以被儀器識別。AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA檢測結果如圖2所示，緩沖液本身不具有熒光信號且ENR核酸適配體與Complementary DNA的雜交產物dsDNA結合AccuBlue釋放的熒光信號遠大于AccuBlue熒光染料本身，且由此可以證明，利用AccuBlue熒光檢測ENR方法可行。

圖2 ENR核酸適配體形成的dsDNA與AccuBlue結合后的 熒光檢測（n=3）Fig. 2 Fluorescence intensity of AccuBlue in the presence and absence of ENR aptamer hybridizer (n = 3)

2.2 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別雙鏈時間的優化

熒光染料AccuBlue通過識別核酸適配體與其互補鏈之間的堿基配對位點，在初始階段隨著反應時間的推移，釋放出的熒光信號不斷增強，直到反應體系中AccuBlue與dsDNA不再結合為止。雙鏈孵育時間優化結果如圖3所示，ENR核酸適配體與其互補鏈反應10 min時，體系中相對熒光強度達到最大值，且處于穩定狀態。因此確定ENR適配體與其互補鏈、ENR藥物的孵育時間為10 min。

圖3 ENR核酸適配體與其互補鏈孵育時間優化（n= 3）Fig. 3 Optimization of incubation time of ENR aptamer and its complementary chain (n = 3)

當加入體系中的AccuBlue和ENR核酸適配體濃度一定時，需要確定在當前濃度條件下熒光強度達到峰值的時間。熒光染料識別雙鏈的時間優化如圖4所示。相對熒光強度在第6分鐘時達到最高點且處于穩定狀態。AccuBlue熒光染料的濃度一定時，相對熒光強度隨dsDNA的增多而增強，達到峰值之后又有輕微的猝滅。因此，選擇6 min作為AccuBlue與樣品的最優反應時間。

圖4 熒光染料識別雙鏈的時間優化（n=3）Fig. 4 Optimization of reaction time between AccuBlue and dsDNA (n = 3)

2.3 ENR定量檢測結果

根據上述確定的最佳反應條件，建立AccuBlue熒光法檢測不同質量濃度ENR的標準曲線。當ENR核酸適配體的量一定時，ENR質量濃度越大，體系中能與互補鏈結合的核酸適配體越少，形成的dsDNA越少，AccuBlue識別dsDNA產生的熒光強度F值越小。溶液中沒有ENR藥物存在時，核酸適配體完全與其對應的互補鏈結合，此時熒光強度F0最大。因此，以F/F0為縱坐標，以ENR質量濃度的對數值為橫坐標建立標準曲線。該方法的標準曲線為Y＝-0.186 8x＋1.186，R2＝0.945 7。ENR在20～1 000 μg/L的質量濃度梯度范圍內存在良好的線性關系，檢出限為9.96 μg/L，定量限為29.97 μg/kg。此外，由表2可知，該方法的平均板內變異系數為6.63%，平均板間變異系數為8.05%。目前應用于ENR的熒光檢測方法還有很多。對比文獻報道的其他熒光分析方法 （表3）可以看出，本實驗建立的AccuBlue熒光法線性范圍較寬、檢測限低，且AccuBlue免標記，操作簡便，整個實驗過程不超過1.5 h。

表2 板內與板間變異實驗（n=6）Table 2 Inter-plate and intra-plate coefficients of variation (n = 6)%

表3 ENR不同熒光檢測方法結果比較Table 3 Comparison of different fluorescence methods for enrofloxacin detection

2.4 特異性實驗結果

圖5 AccuBlue與ENR核酸適配體檢測ENR的特異性分析（n=3）Fig. 5 Specificity evaluation of AccuBlue and ENR aptamer for the detection of ENR (n = 3)

為了考察ENR的核酸適配體與其他結構類似物是否發生交叉反應，同時對ENR、CIP、OFL、ENX進行了檢測，結果如圖5所示。當向反應體系中加入相同質量濃度（1 000 μg/L）的抗生素藥物時，AccuBlue檢測ENR的反應體系所釋放的熒光強度小于其他3 種。這說明反應體系內中有ENR存在時，ENR核酸適配體與ENR發生了特異性結合，只能激發產生少量熒光。而其他抗生素反應體系中，ENR核酸適配體幾乎與互補鏈完全結合，與AccuBlue結合激發產生更多的熒光。由此可知，ENR核酸適配體可特異性識別并結合ENR，與CIP、OFL、ENX基本上不發生交叉反應。

2.5 實際樣品的檢測結果

本實驗選取奶粉、蝦肉和牛肉3 種樣品進行加標回收實驗。按照1.3.6節的方法處理樣品，每種樣品添加3 個不同水平的ENR標準品，用熒光法進行檢測，根據標準曲線計算樣品回收率。由表4可知，3 種樣品的加標回收率范圍為76.54%～98.79%。結果表明，該檢測方法準確可靠，可用于實際動物性樣品中ENR含量的快速檢測。

表4 熒光法測定樣品的加標回收結果（n=3）Table 4 Recoveries of spiked samples by the fulorescence method (n = 3)

2.6 熒光法與ELISA及HPLC測定結果的相關性分析

為了進一步驗證AccuBlue熒光法的準確性，使用ELISA和HPLC方法檢測加入ENR標準的相同樣品（奶粉、蝦肉和牛肉）。ENR標準品及3 種動物食品加標樣品的HPLC見圖6。3 種方法的線性回歸分析結果如圖7所示，采用熒光法測定加標樣品回收率與其他兩種方法都呈現良好的線性關系（R2＞0.96；R2＞0.98），證實了本實驗建立的熒光法檢測ENR殘留方法準確可靠，可應用于實際樣品的快速檢測。

圖6 ENR標準品（a）及奶粉（b）、蝦肉（c）、牛肉（d） 樣品HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of ENR standard (a), milk powder (b), shrimp (c), and beef (d) samples

圖7 熒光法和ELISA（a）及HPLC（b）測定結果的線性回歸分析Fig. 7 Linear regression analysis of fluorescence method versus ELISA (a), and fluorescence method versus HPLC (b)

3 結 論

利用核酸適配體及AccuBlue熒光染料的特點，建立一種基于核酸適配體快速檢測ENR的方法，并對熒光法反應體系進行優化。結果表明，本研究建立的AccuBlue適配體方法在pH 8.5的緩沖溶液中，熒光染料識別雙鏈的時間為6 min，雙鏈孵育時間為10 min的最優反應條件下，ENR在20～1 000 μg/L范圍內線性關系良好，檢出限為9.96 μg/L，定量限為29.97 μg/kg。且與OFL、CIP、ENX無交叉反應，板內變異系數范圍為4.97%～9.31%，板間變異系數范圍為5.83%～10.96%。在3 個不同水平，樣品回收率在76.54%～98.79%之間。通過ELISA方法與HPLC方法進行驗證，R2均大于0.96。由此表明，該檢測特異性、穩定性和重復性良好。本研究建立的AccuBlue熒光法所需設備簡單、成本低、效率高，為食品中ENR的快速和高靈敏檢測提供了新的方案。