超高效液相色譜-串聯質譜法檢測大豆主要過敏原蛋白

李麗芳，黃文勝，張九凱，王彥波，傅玲琳，韓曉祥，陳 穎,

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

大豆（Glycine max[L.] Merr.）是世界衛生組織認定的八大食物過敏原之一[1]。大豆過敏原易在嬰幼兒和幼齡動物體內引發IgE抗體介導的速發型（I型）超敏反應。目前尚無治愈食物過敏的有效療法，避免大豆及其制品的直接攝入是大豆過敏者預防過敏反應的唯一方式。但由于大豆蛋白在食品工業（預制和加工食品）中應用廣泛，很難將其從日常飲食中完全去除[2]。為保護大豆過敏消費者，歐盟、日本、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國家的食品標簽法規要求，任何含有大豆及其制品的食品，無論含量高低都須在包裝上明確標識[3]。 我國GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》中也建議在食品包裝上標識相關致敏物質。盡管各國標簽法規相繼頒布，但因交叉污染或違規而導致食物過敏原未按照規定進行標識的情況仍經常發生[4]。因此，為督促食品生產者自覺遵守過敏原標識相關法規，幫助消費者判斷標簽標識的真實性，研發高靈敏度、快速準確的食物過敏原檢測方法至關重要。

目前，用于檢測大豆過敏原蛋白的方法主要有酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）[5-7]和高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術等[8-9]。基于抗體的ELISA法應用最早也最為廣泛，但食品加工中常用的高壓和熱處理等加工方式易引起蛋白質發生結構變化，導致檢測結果出現假陽性或假陰性[5-7]。近年來，HPLC-MS法因其良好的特異性和靈敏度，在大豆過敏原檢測中的應用逐漸增多。迄今為止，世界過敏原數據庫（http://www.allergenonline.org/）中共收錄了43 種大豆過敏原。其中，大豆球蛋白（包括G1、G2、G3、G4和G5亞基）和β-伴大豆球蛋白（包括α’、α和β亞基）、Gly m Bd 30K（P34蛋白）、Gly m Bd 28K（P28蛋白）以及Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（kunitz trypsin inhibitor，KTI）5 類是主要的大豆過敏原蛋白，組成大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的各亞基均已被證明具有獨立的免疫原性[10-12]。不同的大豆品種中過敏原蛋白的組成和含量存在差異，國內外已經發現不少有關P34等過敏原蛋白缺失[13]以及α’、α、β等亞基缺失[14-15]的大豆種質資源。但現有的基于HPLC-MS技術的檢測方法通常僅以單一的大豆過敏原蛋白[16]/亞基[17-18]或某幾種大豆過敏原[11,19]為檢測目標，未涵蓋大豆中5 大類主要的過敏原蛋白及其亞基。

本研究利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）聯用技術，針對大豆5 大類主要過敏原蛋白的11 種過敏原，篩選出特征標識肽段，建立多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式質譜檢測方法，以期為食物過敏原檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國內外不同地區各類型大豆樣品24 份（表1），由中國農業科學院作物科學研究所國家大豆種質資源庫提供。

尿素、冰乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，ABC）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、乙腈（HPLC級）、甲酸（HPLC級）、10 kDa離心濃縮裝置 美國Sigma公司；胰蛋白酶蛋白酶（MS級） 美國Thermo Fisher-Pierce 公司；低分子質量蛋白標準品Marker 美國Bio-Rad公司；考馬斯亮藍R250 北京克爾慧公司；超純水由Milli-Q超純水凈化系統制備；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AD XR液相色譜儀 日本Shimadzu公司； Q-TOF?6600質譜、Q-TRAP?5500質譜 美國AB Sciex 公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm，300 ?） 美國Waters公司； TissueLyser II型組織研磨儀 德國Qiagebn公司；ME403E型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5418R型離心機、Concentrator plus型真空濃 縮儀 德國Eppendorf公司；Multiskan GO型酶標儀 美國Thermo Scientific公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國Scientific Industries公司；PowerPac Basic型凝膠電泳儀、ChemiDoc型凝膠掃描儀 美國Bio-Rad公司；HNDSY800型水浴搖床 德國Wiggens公司；HH-1型數顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

所有大豆樣品均在液氮作用下研磨成粉末，過80 目篩，4 ℃保存。確稱取1 g大豆粉末并置于50 mL離心管中，以料液比1∶10（g/mL）加入超純水，用1 mol/L NaOH溶液調節溶液pH值至10.0，50 ℃振蕩1 h；4 ℃、4 500 r/min離心20 min后取上清液；將沉淀重懸于10 倍體積的提取緩沖液中，重復上述步驟；將2 次提取的上清液合并，過400 目濾布即得大豆全蛋白提取液；分裝后保存于-80 ℃待用。

1.3.2 提取液蛋白含量的測定

采用Bradford法[20]測定大豆總蛋白的含量。用0.15 mol/L NaCl溶液配制質量濃度為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的BSA標準曲線溶液。將樣品大豆蛋白原液稀釋30 倍。分別吸取各系列質量濃度BSA標準溶液與各樣品稀釋液30 μL，加入1 mL考馬斯亮藍染料，輕搖混勻，室溫靜置2～3 min。使用酶標儀于595 nm波長處測定標準蛋白溶液和樣品稀釋液的OD值，根據標準曲線計算樣品總蛋白含量，實驗重復3 次。提取液中的蛋白質提取率按照下式計算[21]：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

SDS-PAGE分析參照Laemmli[22]的方法：根據Bio-Rad推薦配方分別制備質量分數為12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白樣品稀釋至1 μg/μL并與上樣緩沖液1∶1混勻，95 ℃水浴10 min，上樣量為15 μL，加樣完畢后接通電源，開始時濃縮膠電泳電壓為80 V，到達分離膠后調節電壓為120 V，待溴酚藍指示劑距分離膠底部5 mm時結束電泳，取出凝膠用考馬斯亮藍R250染色約2 h，染色結束后倒去染色液，以適量體積的超純水清洗凝膠以去除殘留染料，再用脫色液（甲醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，V/V））脫色至背景無色，采用Bio-Rad凝膠成像系統進行掃描，利用Quantity One軟件進行圖像分析。

1.3.4 胰蛋白酶消化

參考Wisniewski等[23]的過濾輔助樣品制備（filtration auxiliary sample preparation，FASP）法進行蛋白質酶解。取約200 μg的大豆總蛋白提取物于10 kDa截留超濾管中，加入100 μL 10 mmol/L DTT溶液（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5），37 ℃孵育1 h；加入10 μL 50 mmol/L IAA（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5）于室溫避光放置15 min，將蛋白烷基化；在室溫下以12 000 r/min離心10 min，用100 μL Buffer1（8 mol/L尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗滌樣品；加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，12 000 r/min離心10 min，重復3 次，至超濾管上沒有殘留液體。在超濾管中加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，再以1∶50質量比加入4 μL胰蛋白酶（1 μg/μL，溶于50 mmol/L乙酸溶液中），渦旋混勻，37 ℃過夜酶切。酶解液12 000 r/min離心10 min，然后用100 μL 25 mmol/L ABC溶液洗滌3 次，使小分子肽段進入濾液中。將濾液旋轉干燥，加入質譜水除鹽，重復旋轉蒸干3 次，最后加入100 μL流動相A（0.1%甲酸-2%乙腈-98%水）溶液復溶。

1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS檢測條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，98% A、2% B；0.1～0.5 min，98%～92% A、2%～8% B；0.5～25 min，92%～78% A、8%～22% B；25～31 min，7 8%～6 5% A、2 2%～3 5% B；3 1 ～3 3 m i n，65%～20% A、35%～80% B；33～39 min，20% A、80% B；39～39.5 min，20%～98% A、80%～2% B；39.5～44 min，98% A、2% B。

AB SCIEX TripleTOF?6600質譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）正離子掃描模式；離子化電壓5 000 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；質譜掃描模式：信息依賴型采集工作模式（information dependent acquisition，IDA）；TOF MS模式m/z 350～1 500，500 ms；IDA TOF MS/MS模式m/z 350～1 500， 40 MS/MS，100 ms，IDA閾值100 cps，母離子電荷選擇范圍為＋2～＋5；滾動碰撞能量enabled；動態排除時間12 s；運行時間44 min。

1.3.6 高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃，進樣體積10 μL。梯度洗脫程序：0～0.1 min，97% A、3% B；0.1～10 min，97%～70% A、3%～30% B；10～13 min，7 0%～4 5% A、3 0%～5 5% B；1 3 ～1 3.1 m i n，45%～20% A、55%～80% B；13.1～16 min，20% A、80% B；16.1～20 min，20%～97% A、80%～3% B；20～20.1 min，97% A、3% B。

AB QTRAP?5500質譜條件：ESI正離子掃描參數：氣簾氣壓力35 psi，碰撞氣：Medium，離子化電壓4 500 V，離子源溫度500 ℃，霧化氣壓力65 psi，輔助氣壓力50 psi；正離子掃描Scheduled MRM模式：MRM檢測窗口120 s；掃描時間3 s。

1.4 數據處理

利用高分辨質譜和計算機對胰蛋白酶酶解肽的質荷比（m/z）、保留時間（retention time，RT）和響應強度等原始數據進行IDA，生成wiff文件。從Uniprot數據庫（UniprotKB，http://www.uniprot.org）中檢索并下載大豆蛋白數據庫并導入AB SCIEX公司的ProteinPilot v.5.0軟件，對原始數據進行搜庫處理。ProteinPilot v.5.0軟件參數設定如下：樣品類型：鑒定；Cys烷基化：IAA；消化：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息（identity document，ID）；ID焦點：生物學修飾；檢測到的蛋白質閾值（Unused ProtScore（Conf））：＞0.05（10.0%）；運行錯誤發現率分析。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

樣品蛋白的高效提取是質譜鑒定分析的前提，因此本實驗對大豆蛋白提取緩沖液的組成與pH值、提取料液比及提取溫度和時間等條件進行優化。由于大豆蛋白在堿性溶液中具有良好的溶解性[19]，本實驗對比3 種提取緩沖液（緩沖液a：H2O；緩沖液b：0.03 mol/L Tris-HCl；緩沖液c：0.1 mol/L ABC）在堿性條件下（pH 9.0和pH 10.0）對大豆中可溶性蛋白總回收率的影響。結果顯示，緩沖液a在pH 9.0和pH 10.0時獲得的大豆蛋白提取率均高于緩沖液b和緩沖液c（圖1A）；并采用HPLC-MS/MS 方法檢測不同緩沖液在pH 10.0條件下提取的大豆蛋白酶解肽中目標致敏原特征肽段的得率，經比較分析，當使用堿性水溶液作為提取溶劑（緩沖液a）時，各過敏原特征肽段的響應強度可達到最高值（圖1B），故本研究最終選擇以1 mol/L NaOH溶液作為堿化介質調節的水溶液作為大豆蛋白的提取緩沖液。在此基礎上，調節提取緩沖液的pH值（pH 8.0～12.0），發現pH值為10.0時大豆蛋白提取率最高（圖1C）。通過評估不同料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20（g/mL））下的提取效率，發現料液比為1∶10時大豆蛋白提取效果最佳（圖1D）。為增加大豆蛋白的溶解度，需輔助進行加熱和振蕩處理，進一步考察提取溫度（25～60 ℃）和振蕩提取時間（15～120 min）對其提取效率的影響。結果表明，在50 ℃和60 min的提取條件下獲得了大豆蛋白的最佳提取率（圖1E和圖1F）。在優化的提取條件下完成了所有大豆樣品的蛋白提取，利用Bradford法測得24 個品種中大豆蛋白含量在252.89～329.85 mg/g之間。

圖1 提取條件對大豆蛋白提取效果的影響Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction efficiency of soybean protein

2.2 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE技術分析24 個大豆樣品的蛋白組成，通過與已知的各過敏原相對分子質量進行比對，可準確定位大豆球蛋白的酸性多肽鏈A（34～44 kDa）和堿性多肽鏈B（18～20 kDa）、β-伴大豆球蛋白的α’（72 kDa）、α（68 kDa）和β（52 kDa）亞基、P34（30～34 kDa）、P28（28 kDa）及KTI（24 kDa）相應的條帶位置。由圖2可知，利用本實驗方法提取的大豆總蛋白包括了上述主要大豆過敏原，各過敏原條帶清晰可見，未發生降解，且不同品種間大豆蛋白質的亞基組成及含量存在差異。

圖2 大豆蛋白粗提物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profiles of crude soy protein extracts from different cultivars

2.3 大豆蛋白胰蛋白酶肽的UPLC-Q-TOF-MS分析

按1.3.5節色譜及質譜條件，利用UPLC-Q-TOF-MS對24 份大豆樣品的全蛋白胰蛋白酶消化產物進行分析，得到其在全掃描模式下具有代表性的總離子流色譜圖。以綏農1號大豆種質為例，大豆蛋白酶解產物的分離情況較好，其色譜圖譜峰尖銳，響應強度較高，峰形對稱且重復性好，數據采集情況良好（圖3）。

圖3 大豆蛋白酶解產物在全掃描模式下的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatograms of tryptic digestion products from soybean protein extracts

2.4 特征肽段的篩選

在Uniprot數據庫中搜索并下載大豆蛋白的氨基酸序列，使用ProteinPilot軟件結合Paragon算法針對大豆蛋白質數據庫對經UPLC-Q-TOF-MS分析得到的MS2譜進行搜庫處理，以生成蛋白質、肽序列、豐度和修飾信息的列表，實現蛋白質和多肽的鑒定。在95%置信度下，針對性地鑒定出11 種大豆主要過敏原，即大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基，β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28及KTI。為確定質譜檢測的標志物，對經Uniprot數據庫結果比對后得到的一系列肽段進行篩選。篩選原則如下：長度在7～21 個氨基酸之間；m/z＜1 250；不含任何修飾氨基酸（半胱氨酸（C）與蛋氨酸（M））；不含內部胰蛋白酶切割位點；在酶切位點處沒有連續的精氨酸（R）或賴氨酸（K）殘基[24-28]。根據上述原則，每個目標過敏原篩選得到1～4 條預選特征肽段，共計29 條（表2），其中11 條為本研究首次發現。將所選擇的預選特征肽段利用BLAST分析工具進行UniProtKB數據庫比對，以檢查物種間同源性，確保這些肽段對于其所屬的大豆過敏原具有特異性。比對結果表明，所選特征肽段僅存在于其所屬大豆過敏原中，均可作為大豆過敏原定性定量蛋白質組學研究的候選靶肽。

表2 大豆中11 種主要過敏原的特征肽段信息及其MRM參數Table 2 Information about signature peptides and MRM parameters for 11 major allergens in soybean

2.5 大豆主要過敏原特征肽段的三重四極桿質譜驗證

本實驗利用Skyline軟件對所選特征肽段進行模擬酶解，獲得各肽段適用于質譜分析的理論傳輸離子對（母離子Q1和子離子Q3）、RT、碰撞能量（collision energy，CE）以及去簇電壓（declustering potential，DP）等MRM參數信息，并通過三重四極桿質譜MRM模式對所選特征肽段進行驗證。經碰撞誘導解離后，帶電荷的肽段碎裂成許多小片段，產生y離子和b離子（肽段主鏈片段離子在N和C端保持正電荷），導致每個肽段出現多個峰。之前研究表明，每個特征肽段應至少選擇3 個子離子進行監測，其中響應值最高的離子可作為定量離子，其余兩個離子輔助定性分析[29-30]。以β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR為例，在m/z526.272＋處觀察到該肽的雙質子化離子信號強度最高，該離子的MS2分析結果如圖4所示。m/z580.28＋（y5）、m/z693.37＋（y6）和m/z840.44＋（y7）處的片段碎裂效果最佳，其中y5子離子的響應強度在C-末端y-系列產物離子中最高，適用于MRM監測，而y6子離子和y7子離子分別具有第2和第3高的響應強度。因此，選擇m/z 526.272＋～580.28＋、m/z 526.272＋～693.37＋和 m/z 526.272＋～840.44＋的離子躍遷用于該特征肽段的鑒定。同上方法，獲得其余肽段適用于MRM監測的離子對信息。以綏農1號大豆作為實驗樣本，對特征肽段的RT、CE值和DP值等MRM參數進行優化，最終的HPLC-MRM方法能夠同時監測上述11 種大豆主要過敏原的29 條特征肽段（表2）。圖5顯示了正離子采集模式下綏農1號大豆樣品中上述過敏原特征肽段的提取離子色譜圖，各特征肽段在優化的色譜質譜條件下均得到較好的檢測結果，對應的色譜峰分離效果良好、峰形對稱且響應強度高。

圖4 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR的二級質譜圖Fig. 4 Tandem mass spectrum of signature peptide NPFLFGSNR of β-conglycinin α subunit

圖5 大豆主要過敏原特征肽段的提取離子色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of signature peptides of major allergens in soybean

2.6 特異性驗證實驗結果

用于檢測的特征肽段應具有序列保守性，覆蓋絕大多數大豆品種，因此進一步利用24 個代表性大豆品種對所選擇的特征肽段進行特異性驗證。結果表明，同一條特征肽段在不同大豆品種中的響應強度存在差異，如 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段ESYFVDAQPK在焉耆黃豆中的響應強度最高，而在瑞金青皮豆中的響應強度最低；大豆球蛋白G1亞基的特征肽段VLIVPQNFVVAAR在焉耆黃豆中的響應強度與在上饒八月白中的響應強度相差一個數量級；KTI的特征肽段FIAEGHPLSLK在青豆中的響應強度為泌陽小籽黃的300多倍等。雖然不同大豆品種的肽段/蛋白質的組成和含量不同，但所選擇的29 條特征肽段均存在于被測的24 個大豆品種中（圖6），體現出良好的特異性。該結果與Ma Yingtao等[31]報道的桃脂轉運蛋白（LTPI）的Pru p 3.01過敏原蛋白在不同栽培品種中的含量存在顯著差異的結果一致。

圖6 不同大豆品種中預選特征肽段的質譜檢測結果Fig. 6 Mass spectrometry verification of signature peptides selected for different soybean cultivars

3 結 論

本研究結合Uniprot數據庫和Skyline等生物信息學軟件完成肽段匹配，成功篩選到可用于表征11 種大豆主要過敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基， β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28以及KTI）的特征肽段共29 條，并優化了這些肽段的三重四極桿串聯質譜的MRM檢測參數，利用24 個代表性大豆品種對特征肽段的特異性進行驗證，從而建立了11 種大豆主要過敏原的UPLC-MS/MS-MRM定性檢測方法。與現有大豆過敏原的HPLC-MS/MS檢測方法相比，本方法檢測目標包含了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的所有亞基，檢測結果能夠全面、準確地代表大豆品種和大豆制品中所含的過敏原。

引起食物過敏免疫應答的不是整個過敏原蛋白，而是其中某一段連續的氨基酸序列（線性抗原表位）或由幾段不連續氨基酸序列形成的空間構象（構象表位）。現階段，本實驗所確定的特征肽段中，有些屬于抗原表位的組成部分（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR和ESYFVDAQPK），有些則與抗原表位無關（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段EQQQEQQQEEQPLEVR）。由于在加工食品中蛋白質易發生降解，此時應用本實驗中某些特征肽段得到的過敏原含量可能無法與實際樣品的致敏性強弱相關聯[32]。

本研究下一步將以挖掘到的特征肽段為檢測靶標，合成相應的穩定同位素標記多肽，詳盡考察定量限、檢出限、回收率、重復性等方法學要素，最終建立食品中11 種大豆主要過敏原的定量檢測方法，為大豆過敏研究、大豆脫敏試劑開發以及低致敏性大豆品種培育、嬰幼食品中大豆蛋白含量檢測等提供技術支持，為完善我國食物過敏標簽立法和食品安全監管提供技術保障。