微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法同步檢測白玉菇中Pb、As、Cd及其健康風險評估

徐明芳，岳 甜，傅利軍，劉 莉，張秀敏，馬永征，沈林燕，孫 勇,

（1.暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632；2.北京食品科學研究院，北京 100068）

白玉菇（Hypsizygus marmoreus）又名白玉蕈，如圖1所示，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina），玉蕈屬（Hypsizigus），研究[1]發(fā)現(xiàn)白玉菇是一種高蛋白（21.8%粗蛋白）、低脂肪、富含真菌多糖（7.5%多糖）的食品，子實體叢生、潔白清亮、質(zhì)地脆嫩可口，不僅營養(yǎng)成分豐富，且含有多種生物活性物質(zhì)，具有提高免疫力、清除體內(nèi)自由基、預(yù)防衰老、降低膽固醇、降低血糖和血壓、改善心律等作用[2-3]，享有“聞之松茸，食則玉蕈”的美譽，白玉菇作為近年來從日本引進的一種珍稀品種在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等方面具有重大開發(fā)前景，深受國內(nèi)外消費者青睞的食用菌珍品[4]。

圖1 白玉菇子實體Fig. 1 White H. marmoreus

早在1998年Garcia等[5]研究發(fā)現(xiàn)食用菌子實體具有生物累積金屬離子的能力，且積累量受環(huán)境和食用菌種類的影響。Zhu Fangkun等[6]研究表明食用菌的重金屬富集能力強于其他農(nóng)作物，其濃度比蔬菜和水果中的重金屬濃度高很多，并且食用菌富集重金屬的種類及富集量也都強于一般植物，甚至還可能高于動物[7]。食用菌的重金屬來源主要有栽培料、土壤、水源與空氣4 個方面，其中木本植物對重金屬有一定的吸收積累作用，當農(nóng)林副產(chǎn)品加工成食用菌的栽培原料時，可通過食用菌的生長、轉(zhuǎn)化、富集到食用菌內(nèi)，此外重金屬不能被土壤微生物降解，它們通過食物鏈在生物體內(nèi)富集和轉(zhuǎn)化，超過一定限度時就會對生物體造成毒害作用[8]。因此，對市售白玉菇及其他幾種食用菌重金屬含量差異性分析，并進行健康風險評估具有重要的現(xiàn)實意義。

近些年，有關(guān)食用菌中重金屬含量的研究主要集中在前處理方法及測定方法上。常見的食用菌重金屬檢測前處理方法主要有：干式灰化法[9]、濕法消解法[10-11]、微波消解法[12-15]。郭楠楠等[16]采用不同的前處理方法如干式灰化法、濕法消解法和微波消解法對干香菇進行消解處理，發(fā)現(xiàn)微波消解法處理樣品的回收率高于前兩者。鄧藝萍等[17]用微波消解和濕法消解分別測定了5 個國家標準參考物質(zhì)的金屬元素并進行比較，得出微波消解法具有時間短、試劑用量少、污染低等優(yōu)勢。食用菌重金屬檢測方法的研究主要有原子吸收光譜法[18-20]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[21-22]、原子熒光光度法[23]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法[24]等。其中ICP-MS法被稱為微量元素檢測的金方法，具有檢出限低、準確度高、線性范圍寬、抗干擾能力強，可以分析元素的不同形態(tài)等特點[25-27]。解楠等[28]采用ICP-MS測定上海市場上銀耳、黑木耳、香菇等食用菌中重金屬砷（As）、鉛（Pb）、鎘（Cd）含量，發(fā)現(xiàn)ICP-MS具有對多種元素同時進行快速檢測的優(yōu)點。

食用菌健康風險評估中，有研究[29]根據(jù)GB 2762—2012《食品中污染物限量》規(guī)定的食用菌中Hg限量標準及聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）規(guī)定的每周Hg允許攝入量現(xiàn)行標準，評價云南野生牛肝菌的食用安全性。研究表明，不同產(chǎn)地、種類牛肝菌菌蓋、菌柄中總Hg含量存在明顯差異，少數(shù)牛肝菌總Hg含量超過相關(guān)標準，食用具有一定的潛在風險。張徐惠群等[30]采用原子吸收光度法和原子熒光光譜法測定北京地區(qū)市售的18 種食用菌中Pb、As含量，分析食用菌重金屬含量的整體趨勢，闡明不同品種食用菌的不同測量結(jié)果在概率分布上呈現(xiàn)正態(tài)分布和偏正態(tài)分布的趨勢，可用一定含量范圍即置信區(qū)間代表食用菌中Pb、As元素的含量，評估食用菌中Pb、As含量的健康風險，此外，還有采用污染指數(shù)法進行食用菌污染評價。靶標危害系數(shù)方法（target hazard quotients/total target hazard quotient，THQ/TTHQ）是美國環(huán)境保護局于2000年建立的一種用于評估人體通過食物攝取重金屬風險的一種評估 方法[31-32]，具有既能評價單一重金屬的潛在風險，又能評價多種重金屬復合暴露的健康風險的特點。此外，THQ法是根據(jù)成人及兒童的平均體質(zhì)量而建立的風險分析方法，具有不同年齡段人群的不同參數(shù)，更能體現(xiàn)出不同年齡段人群中存在的健康風險，具有適用性較高的特點。該方法是基于假定污染物吸收劑量與攝取劑量相等，以實驗所測定的人體攝入的污染物劑量與參考劑量的比值作為評價標準，如果單一重金屬風險THQ值小于1， 說明暴露人群并沒有明顯的健康風險，反之，則可能存在潛在的健康風險。考慮到重金屬對人體的危害是由多種重金屬元素共同作用的結(jié)果，可用TTHQ表示多種重金屬復合風險，如果該值小于1，則說明多種重金屬復合對暴露人群沒有明顯的影響，反之，則存在負面影響。與動、植物相比，食用菌具有更強富集重金屬的能力，為了評估食用白玉菇攝入的重金屬與潛在的健康風險相關(guān)性，采用THQ評估非致癌的健康風險具有重要的現(xiàn)實意義。然而不同的消解前處理技術(shù)與檢測方法對食用菌重金屬元素分析會有顯著影響，選擇高效樣品重金屬前處理技術(shù)，建立快速、準確檢測方法，將為食用菌重金屬檢測及其健康風險評估奠定基礎(chǔ)。

本研究采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)（microwave digestion-inductively coupled plasma-mass spectrometry，MD-ICP-MS）建立同步測定白玉菇樣品中重金屬Pb、As、Cd分析方法，通過THQ/TTHQ評價白玉菇中重金屬對人體的健康風險，旨在為白玉菇安全性評價與深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)，也為其他食用菌的重金屬健康風險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

隨機采集當?shù)爻幸约稗r(nóng)貿(mào)市場銷售的袋裝白玉菇、香菇、姬松茸和平菇樣品，各選取50 g樣品，用干凈食品袋包裝帶回實驗室立即進行洗滌、烘干處理。

30%過氧化氫（H2O2）、硝酸（HNO3） 廣州化學試劑廠；As 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Pb、Cd標準溶液 上海麥克林生化科技有限公司。

MARS5微波消解儀 美國CEM公司；7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；超純水儀 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品微波消解處理

食用菌樣品用去離子水洗凈后在50 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，經(jīng)干燥后的樣品用食品多功能機粉碎成粉末，過80 目篩后用自封袋密封備用。精確稱量干食用菌粉0.500 0 g放入100 mL聚四氟乙烯消化容器中，加入4 mL HNO3和4 mL H2O2浸泡，加蓋密封。將消解管對稱放入微波消解儀中，開啟通風，按表1所列微波消解程序消解樣品。冷卻后取出消化液，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，待測，同時做試劑空白和加標回收率實驗。

表1 微波消解過程的參數(shù)Table 1 Parameters of microwave digestion procedure

1.2.2 樣品測定

1.2.2.1 ICP-MS儀器測定參數(shù)

參數(shù)的設(shè)定可直接影響ICP-MS儀器測定的靈敏度、精密度和檢出限。首先用質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)整儀器至最佳工作狀態(tài)，以排除質(zhì)譜干擾，然后采用內(nèi)標校正法進行校正，排除非質(zhì)譜干擾。最后將As、Pb、Cd標準溶液稀釋成系列濃度標準溶液，與空白試劑、樣品溶液分別按表2的儀器工作參數(shù)進行測定，由工作站軟件分析數(shù)據(jù)，通過標準曲線對樣品中3 種重金屬進行定量。

表2 ICP-MS儀器設(shè)置參數(shù)和采集參數(shù)Table 2 ICP-MS parameter settings and acquisition parameters

1.2.2.2 精密度與加標回收率實驗

準確稱取食用菌干粉0.500 0 g，按樣品處理方法進行處理，連續(xù)測定6 次，測量精密度；在樣品中分別加入As 0.5 mg/kg、Cr 0.05 mg/kg、Pb 1 mg/kg元素的標準液，每個元素重復3 次，結(jié)果取平均值計算加標回收率。

1.2.3 重金屬污染評價標準

依據(jù)GB 2762—2017《食品中污染物限量》[33]的規(guī)定，食用菌中各種重金屬最高允許限量標準為As 0.5 mg/kg、Pb 1.0 mg/kg及Cd 0.2 mg/kg。

1.2.4 重金屬接觸人體健康風險評估參數(shù)設(shè)置與計算

健康風險評估中，THQ和TTHQ計算如式（1）、（2）所示：式中：各參數(shù)名稱和取值見表3。

表3 食用菌重金屬THQ分析參數(shù)取值Table 3 Values of the parameters used in the calculation of THQ for heavy metals

單金屬靶標危害系數(shù)THQ大于1，表明該重金屬可引起人體健康風險，THQ值越大則表明該重金屬對人體的健康風險越大；TTHQ為多金屬靶標危害系數(shù)，表示多種重金屬復合污染導致的潛在健康風險，TTHQ大于1，表明多種重金屬復合污染對人體健康風險。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Excel軟件進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 MD-ICP-MS法同步檢測白玉菇中重金屬As、Pb、Cd

2.1.1 線性回歸方程與檢出限

采用MD-ICP-MS法測定As、Pb、Cd標準溶液（0、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL），以質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，擬合回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。以3 倍的信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算檢出限。回歸方程、線性范圍和檢測限如表4所示。

表4 金屬元素的線性回歸方程與檢出限Table 4 Linear regression equations and detection limits of heavy metal elements

由表4可知，As、Cd、Pb的線性范圍為0～100 μg/L， 各元素峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 6。儀器檢出限分別為0.3、0.01 μg/L和0.03 μg/L。

2.1.2 精密度和加標回收率實驗結(jié)果

表5 樣品回收率和精密度實驗（n=6）Table 5 Recoveries and precision (relative standard deviation) of spiked samples (n= 6)

由表5可知，加標回收率在98.84%～100.92%之間，表明所建立的方法準確、可靠。所有元素的相對標準偏差低于6%，證明該方法的重復率高、精密度好。

2.2 白玉菇與及其他食用菌中As、Pb、Cd含量差異性

表6 食用菌中重金屬（As、Pb和Cd）的總體含量Table 6 Average contents of heavy metals (As, Cd and Pb) in edible fungi

如表6所示，3 種重金屬在食用菌中的含量差異較大，且每種重金屬含量變化范圍較寬，變異系數(shù)較高，表現(xiàn)為As（117.13%）＞Cd（108.11%）＞Pb（89.04%），說明不同食用菌種類對同種重金屬的富集能力存在很大差異，與前人研究結(jié)果相同[37]，此外食用菌富集重金屬的量還可能受到環(huán)境條件（空氣、水、土壤）、栽培技術(shù)與原料等其他因素的影響[38]。對于超標率而言，Cd的超標率最高，達到58.33%，As為25%，Pb在這批食用菌中均未超標。

如表7所示，As、Pb、Cd的平均總含量在4 種食用菌中由高到低排序依次為姬松茸＞香菇＞平菇＞白玉菇，且不同食用菌中同一重金屬含量的變異系數(shù)均不同，這進一步說明了不同食用菌富集重金屬的能力不同。其中，白玉菇與香菇Cd超標率達分別到達33.33%與100%；姬松茸中As與Cd的超標率均達到100%；平菇中3 種重金屬的平均含量未超過國家標準。食用菌受Cd污染最嚴重，其次是As。

表7 4 種食用菌中不同重金屬的含量Table 7 Contents of different heavy metals in four types of edible fungi

圖2 4 種食用菌的As、Pb、Cd平均含量及分布Fig. 2 Average contents and distribution of As, Pb, and Cd in four types of edible fungi

從圖2可知，同一重金屬在不同食用菌中含量差異較大，As主要分布在姬松茸中，白玉菇中最少，2者間相差近13.6 倍；Pb也是主要分布在姬松茸中，白玉菇中最低，2者間相差近15.7 倍；Cd則以姬松茸中的最高，平菇最低，2者間相差近50.7 倍。由此可知，重金屬的積累量與食用菌品種有關(guān)，而不同食用菌品種對栽培原料的要求不同，其中，姬松茸屬糞草生菌類，采用土壤栽培法，栽培基料中稻草70%、棉子殼10%、牛糞17.5%、尿素0.5%、過磷酸鈣1%、石膏1%，主要為稻草、麥草等作物的秸稈及牛糞、禽糞和化肥等粗放型物質(zhì)；白玉菇跟其他食用菌類相比是一種比較珍貴的食用菌，工廠化生產(chǎn)采用瓶栽培法，栽培基料為鋸木屑58%、棉籽殼20%、麥麩15%、玉米面5%、石膏1%、石灰1%等精細物料[39]。因此，食用菌重金屬的積累量受栽培原料等其他因素的影響。另外，與對應(yīng)的重金屬國標值相比發(fā)現(xiàn)，姬松茸中As平均值超過國標的4 倍；Pb在這4 種食用菌中均沒有超標；姬松茸和香菇中，Cd平均值分別為國標的8.9、3.8 倍，結(jié)果表明，白玉菇與其他幾種食用菌相比存在Cd殘留風險，姬松茸樣品中存在As、Cd安全風險。

2.3 食用菌途徑攝入重金屬的人體健康風險評估

表8 4 種食用菌中As、Pb和Cd的THQTable 8 THQ of As, Pb and Cd in the four types of edible fungi

如表8所示，對于成人而言，所有的香菇、姬松茸和平菇與部分白玉菇（33.33%）中單一金屬As THQ均 大于1，說明成人攝入所采集的食用菌中的As對健康的危害程度最大；所有姬松茸與部分香菇（66.67%）中的Cd存在THQ值大于1，Cd危害程度其次，從單一重金屬總體的風險看，3 種重金屬成人THQ值由高到底排序為As＞Cd＞Pb，其中白玉菇與平菇存在As攝入健康風險較低，姬松茸與香菇存在As、Cd攝入健康風險較高。對于兒童而言，所有的香菇、姬松茸、平菇與白玉菇中單一金屬As THQ均大于1，說明兒童攝入所采集的4 種食用菌中的As對健康的危害程度最大；所有姬松茸、香菇與部分白玉菇（33.33%）中的Cd存在THQ值大于1，Cd危害程度低于As，從單一重金屬總體的風險看，3 種重金屬兒童THQ值由高到底排序為As＞Cd＞Pb，其中As和Cd在兒童中的THQ值均超過1，說明兒童進食所采集的4 種食用菌存在As和Cd的膳食攝入風險。

表9 4 種食用菌重金屬的TTHQTable 9 TTHQ of heavy metals in the four types of edible fungi

如表9所示，對成人和兒童而言，所有食用菌均存在重金屬TTHQ值大于1的情況，且姬松茸＞香菇＞ 平菇＞白玉菇，兒童攝入3 種重金屬的TTHQ值均高于成人，此外，4 種食用菌重金屬的TTHQ的總體平均值均超過1。本實驗說明，從多種重金屬復合風險看，成人和兒童如果攝入此批姬松茸、香菇存在潛在風險較高，而平菇和白玉菇則潛在健康風險較低，食用菌種類不同，對重金屬的富集能力差異較大，這不僅跟食用菌的培養(yǎng)料有關(guān)，當培養(yǎng)料中重金屬含量升高時，一般情況下該重金屬在食用菌中的含量也會隨之升高[40]，而且食用菌菌蓋（富含孢子）與菌柄（網(wǎng)狀多孔通道）結(jié)構(gòu)的差異性[41]會影響重金屬積累量，食用菌本身的富集能力的差異，例如食用菌種類、子實體形態(tài)部分、發(fā)育階段、菌絲年齡和生化成分差異性也可能導致不同食用菌中重金屬的含量差異較大[42]。

表10 單一重金屬對成人和兒童的復合健康風險貢獻率Table 10 Contribution ratios of single heavy metals in edible fungi to TTHQ for adults and children

如表10所示，As的貢獻率最高，表明4 種食用菌對成人和兒童的復合健康風險主要由As引起，其次是Cd。因此從多種重金屬復合風險看，As和Cd是這4 種食用菌中的主要重金屬污染物，應(yīng)引起重視。

3 結(jié) 論

建立MD-ICP-MS同步測定白玉菇中As、Pb、Cd的方法，在一定范圍內(nèi)，回歸方程線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5，適合食用菌重金屬快速準確檢驗。將此方法用于檢測市售采集的白玉菇中重金屬含量，并與其他3 種菌菇（姬松茸、香菇和平菇）對比重金屬含量差異性，研究發(fā)現(xiàn)，白玉菇與香菇、姬松茸和平菇相比，重金屬的總體平均量最低，姬松茸中的重金屬含量最高，4 種食用菌重金屬的平均含量As＞Cd＞Pb，其中As與Cd均高于國標值，Cd的陽性超標率高于As和Pb，表明不同食用菌富集重金屬的能力具有很大差異。靶標危害系數(shù)法THQ研究結(jié)果顯示，從單一重金屬看，3 種重金屬成人與兒童的THQ值排序均為As＞Cd＞Pb，且As和Cd的THQ值均大于1，說明成人和兒童均存在As和Cd的膳食攝入潛在風險，其中As對健康的危害程度最大；從多種重金屬的總體復合風險看，所有食用菌3 種復合重金屬TTHQ值均大于1，而且白玉菇與其他3 種食用菌對成人和兒童的復合健康風險主要由As引起，其次是Cd，研究提示食用菌栽培過程中栽培料及土壤水質(zhì)等各環(huán)節(jié)的重金屬含量的控制，對于保證食用菌的安全性具有重要的現(xiàn)實意義，該研究將為白玉菇等食用菌深加工產(chǎn)品研發(fā)和質(zhì)量安全性評價提供科學理論依據(jù)。