RP-HPLC混標加樣增量法快速測定食品中的阿斯巴甜和阿力甜

高向陽，張 芳

（鄭州科技學院食品科學與工程學院，鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，河南 鄭州 450064）

阿斯巴甜即天門冬酰苯丙氨酸甲酯，是一種天然功能性低聚糖，甜度是蔗糖的200 倍。在pH 3～5的溶液中穩定，高pH值或高溫下會水解而導致甜味喪失[1-3]。阿力甜又稱為天胺甜精，甜度為蔗糖的2 000 倍以上，極易溶于水或溶于含羥基的溶劑中。室溫下，阿力甜在pH 4的條件下能穩定2 a，在pH 5～8的水溶液中能穩定 4 a以上[4-5]。阿斯巴甜和阿力甜復合使用可以協同增效、降低成本、改善口感、提高甜味的穩定性，不但甜度高、味質好，且儲存期長、無熱量，是常用的食品甜味劑。但若使用過量可能會出現人體肝臟被破壞、神經系統紊亂、致癌等不良影響[6-10]。

目前，食品中測定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色譜法[11-18]、超高效液相色譜法[19]、反相高效液相色譜法[20]、液相色譜-串聯質譜法[21-23]、超高效液相色譜-串聯質譜法[24-26]、離子色譜法[27]等，而且常用外標法、內標法或歸一化法進行定量分析。

外標法需要繪制標準曲線，標準液和待測液要分開進行測定，不能實現同時、同步分析，容易受到儀器條件以及環境因素的影響。內標法需要先用標準液求得各待測組分和內標物的相對校正因子，代入相應公式計算結果。對復雜樣品，有時很難找到合適的內標物，也無法確定樣品中是否不含所用的內標物，很難及時開展工作。歸一化法要求樣品中所有組分全部出峰、并產生測定信號，樣品中各組分的相對含量之和應為100%。要求知道各組分的校正因子，操作較為繁瑣。這些測定方法操作繁雜，需測定空白溶液、繪制標準曲線或進行復雜計算，工作效率較低。

混標加樣增量法是一種新型分析技術，克服了上述分析方法的不足，只需取2 份完全相同的阿斯巴甜和阿力甜混合標準液，依次加入不同體積的試液，混勻后在同一條件下進行測定。以同一保留時間下組分色譜峰信號是否有增加進行定性分析，以混合標準液加樣后色譜峰信號值代入公式進行定量分析，無需繪制標準曲線和測定空白溶液，具有成本低、工作效率高、測定速度快、干擾少、準確度高、適用范圍廣等突出優點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可口可樂、菊花晶、酸奶、濃縮果汁、巧克力制品 市售。

甲醇（色譜純）、乙醇（優級純）、阿力甜標準品（C14H25N3O4S，CAS號：80863-62-3，純度為99.2%） 上海安譜實驗科技股份有限公司；阿斯巴甜標準品（C14H18N2O5，CAS號：22839-47-0，純度為95%） BePune實驗科技有限公司。

1.2 儀器與設備

A100250多管渦旋混合儀 月旭科技股份有限公司； MS150/MS205DU電子天平（十萬分之一） 長沙市秋龍儀器設備有限公司；Dynamica V18R臺式冷凍離心機 北京五洲東方科技發展有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限 公司；Utimate3000(2017LH131)高效液相色譜儀、Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×4.6 mm） 美國賽默飛科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準混合液的制備

乙醇溶液：取40 mL乙醇，與20 mL水均勻混合；80%甲醇溶液：取80 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中；50%甲醇溶液：取50 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

阿斯巴甜和阿力甜標準儲備液的配制（0.50 mg/mL）： 稱取阿斯巴甜0.026 32 g（精確至0.000 1 g），稱取阿力甜0.025 20 g（精確至0.000 1 g），用水將阿斯巴甜和阿力甜分別溶解至50 mL容量瓶內并定容至刻度，置于4 ℃左右的冰箱中保存，有效期為90 d。

1.3.2 試液的制備和測定

阿斯巴甜和阿力甜混合標準工作液系列的配制：將阿斯巴甜和阿力甜標準儲備液用水逐級稀釋，并將2 種標準溶液等濃度等體積混合。分別制得50.00、45.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜的混合標準溶液，置于4 ℃左右冰箱保存，有效期為30 d。

1.3.2.1 碳酸飲料、固體飲料樣品處理

稱取約5.000 0 g（精確到0.001 g）碳酸飲料試樣于50 mL燒杯中，超聲振蕩除去二氧化碳，轉入25 mL容量瓶中，用水定容，備用。

稱取約1.000 0 g（精確到0.001 g）固體飲料試樣于50 mL燒杯中，加10 mL水，超聲振蕩提取20 min，移入25 mL容量瓶中；再向燒杯中加入10 mL水超聲振蕩提取10 min，將2 次提取液移入同一個25 mL的容量瓶中，用水定容，備用。

將上述容量瓶的液體分別4 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm的水系濾膜過濾后得待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.2.2 酸奶、乳飲料樣品處理

稱取5.000 0 g（精確到0.001 g）酸奶試樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇，沉淀酸奶試樣中的蛋白質，蓋緊蓋子；上下輕輕顛倒離心管5 次（不能振搖），將離心管混勻渦旋10 s后，靜置1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液濾入25 mL容量瓶中，濾渣用8 mL乙醇溶液洗滌后再離心，離心后的上清液移入同一個容量瓶，用乙醇溶液定容至25 mL，混勻，用0.45 μm有機系濾膜過濾后得待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.3 色譜分析

取2 份完全相同的混合標準液于離心管A和B中，離心管A中加入體積為VA的待測試液，離心管B中加入體積為VB的待測試液，其中VB＞VA；在同一色譜條件下，對離心管A中混合液進行色譜分析，得出阿斯巴甜保留時間tA1及對應的出峰信號hA1，阿力甜保留時間tA2及對應的出峰信號hA2；對離心管B中混合液進行色譜分析得出阿斯巴甜的保留時間tB1及對應的出峰信號hB1，阿力甜的保留時間tB2及對應的出峰信號hB2。當tA1＝tB1，hB1-hA1＞0，則待測食品中含有阿斯巴甜；當tA2＝tB2，hB2-hA2＞0，則待測食品中含有阿力甜。

1.3.4 測定原理和公式

在一定條件下測定時，測定信號與待測組分的量呈正比，因此有：

在完全相同的條件下測定時，比例常數k相同， 式（1）除以式（2）有：

式中：ρ 為試液中阿斯巴甜或阿力甜的質量濃 度/（μg/μL）；ms為混合標準液中阿斯巴甜或阿力甜的質量/μg；VA為離心管A中加入試液的體積/μL；VB為離心管B中加入試液的體積/μL；mA和mB分別為試液加入A管和B管中的組分質量/μg；V樣為總的試液體積/μL； m樣為總樣品質量/g；m為總樣品中阿斯巴甜或阿力甜的質量/μg；hA、hB分別為A、B離心管中阿斯巴甜或阿力甜測得峰高信號值。

2 結果與分析

2.1 條件的選擇

2.1.1 色譜流動相的選擇

用不同比例梯度的甲醇和水作為流動相，阿斯巴甜和阿力甜能很好得到分離，最佳流動相為甲醇-水（40∶60，V/V），流速為0.8 mL/min。

2.1.2 波長的選擇

基于阿斯巴甜和阿力甜在紫外光區的檢測靈敏度，選擇200 nm波長檢測，確定阿斯巴甜和阿力甜的保留時間如圖1所示，結果表明，阿斯巴甜與阿力甜出峰較好。

圖1 阿斯巴甜和阿力甜混合標準溶液的保留時間色譜圖Fig. 1 Chromatograms showing retention times of mixed standard solution of aspartame and alitame

2.2 加樣增量法色譜圖比較分析

圖2 阿斯巴甜和阿力甜混合標準液加不同量可口可樂色譜圖Fig. 2 Chromatograms of in aspartame and alitame in Coca-Cola added with different amounts of mixed standard solution

取2 個相同的離心管A、B，各加10 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合標準液50 μL，再向離心管A中加入100 μL可口可樂待測試液，向離心管B中加入200 μL可口可樂待測試液，均定容至1.00 mL，混勻后進行色譜分析。由圖2 可知，阿斯巴甜和阿力甜在各自保留時間下，加入不同體積的可口可樂試液后，各自的峰高均有增加，保留時間允許的誤差范圍內tA1＝tB1，hB1-hA1＞0，則可口可樂中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2＞0，則可口可樂中含有阿力甜，以此進行定性分析。

由圖2A可得，阿斯巴甜保留時間tA1為3.643 min，峰高hA1為10.188 mAU，阿力甜保留時間tA2為6.527 min，峰高hA2為6.260 mAU；如圖2B所示：阿斯巴甜保留時間tB1為3.633 min，峰高hB1為11.464 mAU，阿力甜保留時間tB2為6.520 min，峰高hB2為7.163 mAU。根據色譜圖的峰高，依據式（3）、（4）可對樣品中的組分進行定量分析。

表1 樣品的測定結果Table 1 Results obtained from determination of aspartame and alitame in real samples

2.3 加樣增量法測定結果及精密度

由表1可知，5 種試樣測定的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%。由色譜峰高值，可簡便、快速計算出食品中待測組分的含量，也可用峰面積數據代入相應公式計算。

2.4 樣品的檢出限和定量限結果

表2 樣品的檢出限和定量限Table 2 Detection limits and quantitation limits for real samples

根據表1，按3 倍標準差計算檢出限，按10 倍標準差計算定量限，見表2。由GB 5009.263—2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》的檢出限和定量限可知[28]，碳酸飲料、液態乳飲料中的阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為 1 mg/kg，定量限為3 mg/kg，巧克力制品、水果及其制品、固體飲料及其制品中的阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg。該方法的檢出限和定量限均低于國家食品安全標準中的檢出限和定量限。

2.5 加標回收率結果

以酸奶測定加標回收率，分別對樣品進行3 個水平的加標回收，每個水平做6 次平行測定，檢驗無可疑值后，取峰高平均值計算，見表3。

表3 樣品的加標回收率Table 3 Recoveries for spiked samples

由表3 可知， 酸奶中阿斯巴甜的回收率為90.5%～98.3%，阿力甜的回收率為93.2%～95.8%。由于各組分在色譜柱中得到了充分分離，互不干擾，尤其適用于多組分的色譜定性和定量分析，由各組分依次出現的色譜峰信號值，可快速計算各組分含量和回收率。

2.6 國標法對比實驗

2.6.1 國標法標準曲線的回歸方程

按國標法規定的波長和色譜條件，以5 0.0 0、45.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00 μg/mL和0.50 μg/mL的標準混合使用液各進樣5 μL測定，以組分質量濃度為橫坐標，以峰高為縱坐標繪制標準曲線，得出阿斯巴甜的回歸直線方程為Y＝4.692 1x-1.464 9，阿力甜的回歸直線方程為Y＝2.883 6x-1.194 4，相關系數r均為0.999 9。

2.6.2 國標法測定結果

表4 國標法測定結果Table 4 Comparison of results obtained from determination of aspartame and alitame in real samples by the proposed method and the national standard method

按國標法操作步驟，各樣品均進行6 次平行測定，檢驗無可疑值后，取平均值報告，見表4。國標法采用外標法繪制標準曲線并測定樣品中待測物質的含量。結果表明，阿斯巴甜和阿力甜含量最低的為酸奶，最高的為巧克力，RSD前者為0.7%～4.8%，后者為0.48 %～2.2%。

2.7 顯著性檢驗結果

表5 本實驗方法與國標法對照測定結果Table 5 Comparative statistical analysis of aspartame and alitame contents of yogurt determined by the proposed method and the national standard method

以酸奶為樣品，樣品前處理依據GB 5009.263—2016，用該法和國標法進行對照實驗，各樣品進行6 次平行測定，結果如表5所示。由表5數據和參考文獻[29]可知：F值＜F0.05＝5.05，表明混標加樣增量法與國標法之間不存在顯著的偶然誤差；t值＜t0.05＝2.23，表明混標加樣增量法與國標法間也不存在顯著的系統誤差，結論的置信度為95%。

3 結 論

方法所用標準溶液、待測液和試劑量少，成本低，操作簡單，無需繪制標準曲線、無需測定空白和復雜計算，可快速獲得分析結果。實現了標準溶液和試液在同溶液背景、同體系、同方法、同儀器、同條件、同步操作下進行同時定性、定量分析，準確度得到保障和提升，有一定的創新性。由于各組分在色譜柱中得到了充分的分離，相互之間不干擾，尤其適用于色譜多組分的同時定性和定量分析。與國標法對照，用于測定食品中的阿斯巴甜和阿力甜，經檢驗無顯著性差異。

該法不僅適用于液相色譜法，也適用于氣相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、毛細管電泳色譜法，以及化學發光、分子熒光、磷光分析法、生物發光分析法、原子發射光譜、原子吸收光譜、原子熒光光譜和紫外、可見分子吸收光譜等諸多分析技術。不僅適用于阿斯巴甜和阿力甜的測定，也適用于其他物質諸多組分的測定。根據所用方法不同，測定信號可以是色譜峰峰高、色譜峰峰面積、相對發光強度、吸光度等，可行性和推廣應用領域十分廣泛。