乳酸菌富硒發酵研究進展

朱軍燕，李煥梅，王硯妮，龍 同，高 娃，趙 筱，趙錦芳

（1.湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068；2.湖北省農業科學院生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

硒是人體所必需的一種微量元素，具有抗腫瘤、抗氧化、增強人體免疫等生物學活性。缺硒可能導致心肌梗塞等疾病，與無機硒相比，有機硒吸收利用率高、營養價值好、使用安全、無毒副作用，是補硒的首選。近年來，通過微生物轉化法生產有機硒研究取得了較快發展，富硒發酵工藝條件已趨成熟。目前在富硒微生物的研究中，酵母通常作為首選載體。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，能利用葡萄糖產生50% 以上的乳酸，是能產生乳酸的一類細菌的總稱。在自然界中種類繁多，分布廣泛，目前已發現的乳酸菌有43 個屬，包括373 個種和亞種［1］。作為益生菌中的一個類群，乳酸菌被廣泛應用于食品、輕工、醫藥及飼料工業等許多行業。近年來，富硒乳酸菌因為其突出的抗氧化、抑菌、抗癌及抗突變等特性，受到學者的普遍關注。研究發現，作為一種元素富集型益生菌，許多乳酸菌能夠吸附無機硒并將其生物轉化成有機硒［2-4］。現已報道的具有富硒能力的乳酸菌主要集中于乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和乳球菌屬（Lactococcus）。本文對不同乳酸菌液體富硒發酵研究的現狀進行綜述，以期為富硒乳酸菌的選育和開發利用提供理論支撐。

1 乳桿菌屬

已報道的具有富硒作用的乳桿菌很多，如鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）［5］、保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）［6］、布氏乳桿菌（L. buchneri）［7］、羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）［8，9］、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）［9］、干酪乳桿菌（L. casei）［10］、短乳桿菌（L. brevis）［11］、植物乳桿菌（L. plantarum）、副干酪乳桿菌（L. paracasei）、類布氏乳桿菌（L. parabuchneri）［12］等。

1995 年，Calomme 等［13］對3 株乳酸菌進行富硒培養時發現，當培養基中硒濃度為1 mg/L 時，德氏乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC 11842）、植物乳桿菌（L. plantarum ATCC 14917）和干酪乳桿菌干酪亞種（L. casei subsp. casei ATCC e393）3 株菌的富硒量分別為253、375、407 μg/g 干菌體，這是乳桿菌對硒具有富集作用的首次報道。

汪波等［14］對嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌3 株乳酸菌進行了耐硒能力比較，發現嗜酸乳桿菌耐硒能力最強，當含硒量為17 μg/mL 時，37 ℃下培養9 h，富硒率達到65.4%。

Saini 等［15］對25 株乳酸菌進行了耐硒、富硒能力試驗，在MRS 培養基中添加10 μg/mL 亞硒酸鈉，37℃發酵24 h 后，利用電感耦合等離子體發射光譜法（ICP）測定總硒含量，其中2 株乳桿菌（L. reuteri NCDC77 和L. reuteri LB2 DSMZ）富硒量最高，分別為820.0、742.5 μg/g。

M?rschb?cher 等［12］對尼泊金乳酸桿菌［L. parabuchneri（ML4）］、副干酪乳桿菌［L. paracasei（ML13、ML33、CH135 和CH139）］、植物乳桿菌［L. plantarum（CH131）］和 糞 腸 球 菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］8 株乳酸菌富硒能力進行研究，在硒濃度為150 mg/L 時，L. paracasei ML13 和L. paracasei CH135 的富硒量最高，分別為38.1、40.7 mg/g。其他幾種乳桿菌富硒發酵條件見表1。

表1 富硒乳桿菌發酵條件

2 鏈球菌屬

2004 年，宋照軍等［23］從酸奶中分離純化出嗜熱鏈球菌，通過濃度梯度法進行耐硒馴化后，采用番茄酵母培養基，接種量10%，培養溫度39 ℃，pH 7，第6 天加硒，硒濃度為15 μg/mL，培養11 h，富硒率為72.8%。隨后，孫林超［24］采用同樣的方法獲得嗜熱鏈球菌，利用番茄酵母培養基，加硒時間為第5 天，硒濃度為16 μg/mL，接種量為10%，培養時間為10 h，培養溫度為39 ℃，pH 為7，富硒率為71.6%。

此外，黃秀錦［25］用乳酸菌發酵劑（M）（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）水解脫脂乳培養基，最佳發酵條件為培養基初始pH 6.6，亞硒酸鈉濃度為18 μg/mL，裝液量為150 mL/250 mL 三角瓶，接種量5.5%，培養溫度42 ℃，培養時間45.5 h。在此優化條件下，富硒乳酸菌生物量可達6.85 g/L，細胞硒含量達1 100 μg/g，硒總含量可達7 536 μg/L，細胞硒含量的92.15% 為有機硒。

張慶慶等［26］采用紫外-氯化鋰誘變法對嗜熱鏈球菌進行復合誘變，篩選得到1 株高富硒率的嗜熱鏈球菌突變株ZZ-CW4，富硒率高達83.43%。

有研究者通過誘變、馴化等手段，篩選并獲得硒多糖高產嗜熱鏈球菌菌株，通過單因素試驗、響應面法優化發酵條件，建立嗜熱鏈球菌胞外含硒多糖的合成新工藝，并開發出高生物硒含量的混合菌株制劑［27-29］。

楊鶴［30］研究了5 種乳酸菌單菌和復合菌富硒能力及條件，在MRS 培養基中添加亞硒酸鈉濃度為6 μg/mL，1% 接種量，37℃條件下培養，發酵至36 h時，嗜酸乳桿菌08001 與植物乳桿菌富硒轉換率分別為66.37% 和55.81%，嗜熱鏈球菌3.3 富硒轉換率在60 h 最高，達66.09%。嗜熱鏈球菌3.3 與保加利亞乳桿菌L5 的復合菌的富硒能力較好，在60 h時達到最大值70.44%，嗜熱鏈球菌3.3 與保加利亞乳桿菌L9 在60 h 的富硒轉換率為50.08%。通過研究證實，添加2% NaCl 可以使嗜酸乳桿菌08001的富硒能力提高到70.51%。

近幾年，Yang 等［31］對乳酸菌富硒發酵進行了較為系統的研究，在不同條件下用德式乳桿菌亞種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行富硒培養，使用響應面方法優化Se 富集的初始pH、接種量和溫度。結果表明，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適初始pH、接種量和溫度分別為5.96、6.73%、33 ℃和6.37、6.00%、40 ℃，保加利亞乳桿菌對硒的富集率達94.34%，嗜熱鏈球菌則達97.05%。隨后又研究了2 株乳酸菌L. delbrueckii ssp. Bulgaricus XN-L 和S. thermophilus XN-S 的抗菌活性，通過平板菌落計數法確定適合菌株生長的亞硒酸鈉濃度為80 μg/mL，富硒乳酸菌XN-L 和XN-S 富硒量分別為12.05、11.56 μg/mL［32，33］。此外，通過對13 株乳酸菌的富硒能力和生物活性進行比較研究，發現植物乳桿菌L. plantarum WY3 耐硒質量濃度最高，為100 μg/mL，嗜熱鏈球菌S. thermophilus WY12 的富硒率最高，為79.19%［34］。

2019 年，Casta?eda-ovando 等［35］在最新的研究中發現，嗜熱鏈球菌在絲氨酸存在的條件下可以將亞硒酸鹽轉化為硒代半胱氨酸。

3 腸球菌屬

宋拓等［36］研究了富硒乳酸糞腸球菌（E. faecalis）微膠囊包埋工藝，獲得產品率為82.68%，包埋后菌體存活率為72.15%，菌體硒含量為0.571 mg/g。包玉清等［37］對乳酸糞腸球菌最佳發酵產量和富硒量條件進行研究，硒添加量35 mg/L、接種量10%、發酵時間28 h、pH 4.5～6.3，經發酵獲得的菌體產量為404.10 mg/100 mL，干物質產量683.14 mg/100 mL，菌體富硒量248.56 μg/100 mL，干物質富硒量393.21 μg/100 mL，發酵液環境硒量31.07 mg/L，干物質非有機硒量147.65 μg/100 mL。

2011 年，Pieniz 等［38］分離鑒定了36 株具有硒吸附能力的乳酸菌，其中E. faecalis LAB 14 和E.faecium LAB 18 對硒吸附能力最強，富硒量分別為475.9、459.9 μg/g。2013 年，該研究組又分離出1 株性狀優良的耐久腸球菌E. durans LAB18s，發酵用腦心浸液肉湯培養基（BHI），初始添加240 mg/L 亞硒酸鈉，在pH 為7.0，溫度30℃發酵24 h，其富硒量最大可達176.97 mg/g 干菌體［39］。2017 年，他們又研究分析了E. durans LAB18s 生物量中有機硒的分布，發現總蛋白中有機硒含量最高，其次是多糖和核酸。采用不同提取方法得到的蛋白質組分中，堿溶性蛋白質的硒含量較高［40］。

2018 年，M?rschb?cher 等［12］研究了包括糞腸球菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］在內的8 株乳酸菌的富硒能力，發現在培養基中添加30 mg/L 或60 mg/L 亞 硒 酸 鈉，E. faecalis CH121 和CH124 的富硒能力均很弱，僅為0.7 mg/g，菌體生物量也僅能達到23% 和17%。

2019 年，董曉芬等［41］篩選獲得1 株富硒能力強且適宜發酵枳椇液的屎腸球菌E. faecium，在接種量為1%（v/v）、亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL、36 ℃培養24 h 條件下，富硒率達39.06%。

4 乳球菌屬

齊睿婷等［42］對乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. Lactis LQ-12）富硒發酵工藝進行優化，采用BLX 培養基，當接種量8% 時，培養24 h，亞硒酸鈉濃度為14 μg/mL，溫度37 ℃，pH 6.6 時，乳酸乳球菌的有機硒轉化率為59.87%。2015 年，Pusztahelyi等［43］篩選獲得4 株高耐受硒的突變株Enterococcus faecium W54、Bifidobacterium animalis ssp. Lactis BB12、Lactobacillus casei 431 和Lactococcus lactis ssp.Lactis R703。在MRS 培養基中添加不同濃度NaHSeO3發酵后，各菌株富硒量均很高，E. faecium W54為54 362 mg/kg，L. casei 431 為37 428 mg/kg，R703為64 726 mg/kg，表現出很好的工業化應用潛力。

此外，李艷嬌等［44］從泡菜中分離出活力強的乳酸菌，發酵有機米糠富集亞硒酸鈉。最佳發酵條件為有機米糠添加量34 g、培養基裝液量55 mL、接種量9%、種 齡8～16 h、發 酵 時 間48 h、發 酵 溫 度37 ℃、亞硒酸鈉添加量100 mg/L；經發酵乳酸菌的生物量可達9.94 g/L，有機硒的生產水平為7.46 mg/L。胡惠影等［45］對高富硒乳酸菌進行篩選研究，采用MRS 培養基，5% 接種量，培養溫度37 ℃，適宜加硒時間為培養后8 h，培養時間為24 h，硒濃度為10 μg/mL 時，菌株JZ-07 富集轉化硒能力最強，富硒量達19 413 μg/g 干菌體，轉化率為89.00%。

5 小結

富硒益生菌產品具有廣闊的應用前景，已成為研究熱點。酵母是目前公認的有機硒富集最佳載體，而乳酸菌因其良好的風味和保健功能，已成為有機硒的一個新型來源。目前國內外對乳酸菌在抗氧化、抗菌及抗癌等領域的研究報道很多，關于其富硒發酵研究也日趨成熟，主要集中于富硒菌株的篩選（耐硒菌株的馴化、誘變）和培養條件優化（培養基、初始pH、溫度、發酵時間、接種量、硒添加量、加硒方式等），以獲得高富硒量和高生物量為目標。隨著乳酸菌后基因組時代的到來，不同種屬乳酸菌的硒代謝途徑及控制機理還有待進一步深入研究，以期為富硒益生菌的開發提供參考和借鑒。