豬偽狂犬病最新研究進(jìn)展

向 敏，夏 瑜，王定發(fā)，邵志勇，李中心，阮 征，張四化，劉開武，萬學(xué)濟(jì)，李新玉，史永梅，程 蕾

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430016；3.鄧州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄧州 474150）

豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）感染是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種多種動(dòng)物共患的、急性接觸性傳染病。雖然在一些使用gE-deleted 疫苗的國(guó)家商業(yè)豬群中已經(jīng)根除了這種疾病，但在許多國(guó)家尤其是在豬群密集的地區(qū)，PR仍然是豬最重要的疾病之一。PR 能夠與豬細(xì)小病毒病、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型病及遲發(fā)型豬瘟病造成共感染或者混合感染，是豬重要的病毒性傳染病之一，20 世紀(jì)60 年代以前，PR 在中國(guó)已經(jīng)流行［1］。中國(guó)為了控制豬PRV 感染，1979 年從匈牙利進(jìn)口了Bartha-K61 疫苗株，自20 世紀(jì)80 年代末以來，Bartha-K61 疫苗在中國(guó)得到廣泛應(yīng)用，并取得了良好的效果，豬群新生仔豬的發(fā)病率和死亡率低于10%［2］。但在2011 年底，很多豬場(chǎng)PR 發(fā)生突然，進(jìn)展迅速，感染率高；疫苗保護(hù)效果不佳，損失慘重［3］。這使得原本穩(wěn)定的偽狂犬病又開始在中國(guó)肆虐。甚至接種了Bartha-K61 弱毒疫苗的規(guī)模化豬場(chǎng)也出現(xiàn)了豬偽狂犬的發(fā)病，流行趨勢(shì)愈演愈烈［4］，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了預(yù)防、控制并最終根除該病，各國(guó)研究學(xué)者對(duì)該病進(jìn)行了大量的研究，同時(shí)建立了許多針對(duì)該病的研究和診斷方法，現(xiàn)就PR 的研究進(jìn)展綜述如下。

1 病原學(xué)和流行病學(xué)

1.1 病毒結(jié)構(gòu)和特性

偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，水痘-帶狀病毒屬。成熟的PRV 病毒粒子為球形，直徑為120～300 nm，其大小差異多由病毒體皮層的厚度變化及包膜的完整性所致，成熟完整的PRV 病毒顆粒與其他的皰疹病毒相似，有4 層結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外依次為核心、衣殼、被膜和囊膜。PRV是皰疹病毒中抵抗惡劣環(huán)境能力比較強(qiáng)的一種。PRV 在液體中或固體表面至少能存活7 d，在豬舍內(nèi)干草上的病毒夏季可存活30 d，冬天可達(dá)46 d。55～60 ℃經(jīng)過30～50 min 才能滅活，而80 ℃需要3 min 才能滅活。盡管PRV 比單純皰疹病毒更耐熱，但病毒不能保存于4～30 ℃條件下，否則病毒的感染力會(huì)在兩周內(nèi)降至原來的10%。最適保存溫度為-70 ℃，真空干燥低溫保存的病毒培養(yǎng)物能夠保存多年［5］。

1.2 病毒感染動(dòng)物機(jī)體過程

皰疹病毒為了保持其在宿主種群中始終存在，在宿主的神經(jīng)系統(tǒng)中建立了潛伏感染。感染、潛伏感染和再激活是病毒存活關(guān)鍵的循環(huán)。通過研究，人們已知PRV 的DNA 既可以以附體的形式存在，也可以插入潛伏感染的神經(jīng)細(xì)胞DNA。一方面，潛伏的基因一般為沉默基因，當(dāng)受到外界的刺激后，潛伏感染可被再激活，病毒可通過軸突運(yùn)輸返回外周組織，通過口、鼻或生殖道分泌物排毒。另一方面，PRV 潛伏感染的細(xì)胞可能逃避了免疫系統(tǒng)的清除。在研究PRV 對(duì)細(xì)胞凋亡的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，PRV 可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞死亡，阻礙或延遲被病毒侵染的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并在被侵染細(xì)胞內(nèi)最大限度地增值。因此，在免疫細(xì)胞遭到破壞時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)不一定能清除含有被PRV 侵染的細(xì)胞［5］。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)及流行分布

自2011 年10 月以來，中國(guó)大部分省份出現(xiàn)了PR 大范圍暴發(fā)流行，其特點(diǎn)是：發(fā)病豬場(chǎng)PRV 野毒抗體（gE 抗體）陽性率顯著上升，豬發(fā)病率達(dá)50%。2012 年中國(guó)首次頒布了《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疾病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》，將PR 列為重點(diǎn)優(yōu)先防治動(dòng)物疫病之一。通過加大疫病監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查等措施，計(jì)劃在2020 年底前將PR 凈化或根除［6］。為此，陸續(xù)有學(xué)者對(duì)PRV 野毒在不同年份、不同區(qū)域、不同季節(jié)和不同豬群的感染情況做了流行病學(xué)調(diào)查。

鄒敏等［7］調(diào)查了2012—2013 年全國(guó)18 個(gè)省份393 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)組織樣品，采用PCR 和ELISA 方法對(duì)14 801 份血清樣本和14 個(gè)省份的1 127 份組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示2012—2013 年，PRV野毒感染總體陽性率為24.82%，豬場(chǎng)陽性率為66.51%。不同地區(qū)均存在不同程度的PRV 野毒感染，感染率呈逐年上升趨勢(shì)。Liu 等［8］調(diào)查了2013—2016 年全國(guó)28 個(gè)省份的100 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)偽狂犬病gB 抗體和gE 抗體陽性率，采用ELISA 方法對(duì)14 147 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PRV-gB 陽性率保持穩(wěn)定（＞90%），PRV-gE 陽性率呈逐年下降趨勢(shì)且不同地區(qū)流行程度不一，呈散發(fā)和地方性流行。

Sun 等［9］調(diào)查了2012—2017 年中國(guó)27 個(gè)省豬偽狂犬病在不同季節(jié)gE 抗體陽性率，采用PCR 方法對(duì)16 256 份樣本進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)查結(jié)果顯示在不同月份和季節(jié)中，春季（3、4 月）和冬季（11、12 月）豬偽狂犬病野毒感染陽性率比其他季節(jié)和月份稍高。偽狂犬病的流行以寒冷的冬、春季節(jié)多發(fā)。寒冷季節(jié)低溫有利于病毒在環(huán)境中存活，增加感染宿主的概率，冬、春季節(jié)早晚溫差大，氣溫變化比較劇烈，且冬、春季豬舍封閉，通風(fēng)不良，降低了豬的免疫力，有利于病毒感染和潛伏病毒的激活，導(dǎo)致偽狂犬病例增多。

黨占國(guó)等［10］調(diào)查了2012—2015 年中國(guó)16 個(gè)省不同豬齡不同類型的豬群gE 抗體陽性率，采用ELISA 方法對(duì)3 549 份樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在不同階段豬群中，后備母豬感染率最高，其次是育肥豬和哺乳仔豬。

血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)各省份都存在偽狂犬病毒流行，但流行程度不一，多為潛伏感染。不同豬場(chǎng)野毒感染程度差異大，不同生長(zhǎng)階段偽狂犬病毒感染率也不同，主要呈散發(fā)和地方性流行。

2 豬偽狂犬病毒變異株研究

2011 年10 月以后，中國(guó)多個(gè)省份使用Bartha-K61 弱毒株疫苗的規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生豬偽狂犬病的流行，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征。隨后多名學(xué)者分離到新病毒，并且證實(shí)為PRV變異株。楊濤等［11］在分子水平上通過二代測(cè)序方法比較了Bartha-K61 疫苗株與當(dāng)前流行的豬偽狂犬病病毒變異株之間的免疫原性差異。分析結(jié)果顯示，Bartha-K61 疫苗株與變異株gB 蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)59～126、214～289、507～734 位氨基酸處均存在差異，與gC 蛋白抗原指數(shù)之間發(fā)生了漂移，與gD蛋白共有10 處特征性差異，其中第277 位和第278位插入了RP。這些差異可能引起B(yǎng) 細(xì)胞線性表位和構(gòu)象表位發(fā)生變化，引起免疫逃逸，導(dǎo)致不能提供完全的保護(hù)。

范克偉等［12］對(duì)2013—2014 年閩西地區(qū)分離到的15 株P(guān)RV 中g(shù)E 基因進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果顯示，gE 氨基酸序列在第48 位和第496 位各有1 個(gè)天冬氨酸（D）的插入，雖然部分經(jīng)典毒株在第48 位也有天冬氨酸插入，但2012 年以來國(guó)內(nèi)不同省份陸續(xù)分離的PRV 變異株在這2 個(gè)位點(diǎn)卻高度一致。此外，趙鴻遠(yuǎn)等［13］發(fā)現(xiàn)吉林省、黑龍江省分離的PRV 在gE 蛋白這2 個(gè)位點(diǎn)也各存在1 個(gè)天冬氨酸的插入，與參考文獻(xiàn)［12］結(jié)果一致，該插入特征為PRV 變異毒株的重要標(biāo)志。此外，gE 蛋白N 端的第33～100 位氨基酸具有高度的抗原性和免疫原性。而變異株在該區(qū)段有4 個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，這些位點(diǎn)的氨基酸改變可能會(huì)對(duì)抗原性產(chǎn)生一定的影響，這也可能是導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗對(duì)當(dāng)前PRV 新流行毒株不足以提供完全保護(hù)的原因之一。

另外，國(guó)內(nèi)學(xué)者也做了相應(yīng)的動(dòng)物試驗(yàn)。Luo等［14］從Bartha-K61 免疫豬群中分離到偽狂犬病變異毒株（TJ 株），免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Bartha-K61 的免疫保護(hù)力僅為33.3%。Gu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)Bartha-K61 免疫豬群產(chǎn)生針對(duì)新分離毒株ZJ01 的中和抗體水平較低，經(jīng)新分離毒株ZJ01 攻毒后，Batha-K61 免疫豬群均表現(xiàn)出抽搐、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。

綜上研究結(jié)果表明，對(duì)于當(dāng)前流行的PRV 變異株的致病力顯著強(qiáng)于經(jīng)典毒株，傳統(tǒng)疫苗（Bartha-K61 株）已不能提供全面而有效的保護(hù)力。原因可能有兩點(diǎn)：一是流行毒株發(fā)生變異，并存在免疫逃逸現(xiàn)象；二是狂犬病毒毒力基因發(fā)生了位點(diǎn)的缺失或突變，使偽狂犬流行毒株的毒力增強(qiáng)，疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力不足以抵抗強(qiáng)病毒入侵，從而導(dǎo)致免疫失敗［11］。

3 診斷方法

3.1 臨床診斷

豬感染偽狂犬病毒后，臨床癥狀和病程根據(jù)年齡不同有很大差異（表1）。

3.2 血清學(xué)診斷

在豬偽狂犬病的診斷方法中，利用血清學(xué)方法對(duì)豬血清展開抗體檢測(cè)是常用的診斷手段，不同的血清學(xué)方法有著不同的特點(diǎn)（表2）。

3.3 鑒別診斷

在豬偽狂犬病診斷中，鑒別診斷ELISA 是一種新型診斷方法。目前基因缺失、疫苗缺失的非必需基因主要是gC、gE 和gG［16］（表3）。目前世界范圍內(nèi)，所有PRV 疫苗均缺失gE 基因，能夠通過gE—ELISA 方法實(shí)現(xiàn)鑒別診斷。統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)為PRV 的防控和凈化打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

表1 豬不同生長(zhǎng)階段感染PRV 的臨床癥狀

表2 不同血清學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

表3 PRV 鑒別診斷優(yōu)缺點(diǎn)

4 疫苗

4.1 豬偽狂犬病滅活疫苗

偽狂犬病滅活疫苗主要是以偽狂犬病毒野毒直接滅活或以基因缺失的病毒滅活以后加入適當(dāng)佐劑制備的。偽狂犬滅活苗安全性高，不會(huì)向外界排毒，也不存在因疫苗毒在體內(nèi)發(fā)生變異和重組而致毒力增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)［17］，因此，PRV 滅活疫苗可以用于所有豬群的免疫，包括仔豬和妊娠母豬。目前鑒于鑒別診斷的需要，使用特定基因缺失的PRV 滅活疫苗被廣泛接受。母豬免疫后，能產(chǎn)生較高水平的母源抗體，給仔豬提供被動(dòng)免疫。但與活疫苗相比，滅活疫苗缺點(diǎn)也很明顯，滅活疫苗不能誘生可能在保護(hù)性免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)（CTL），肌內(nèi)注射滅活疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM、IgG1 與IgG2，但沒有黏膜IgA 產(chǎn)生，因此局部免疫效果不及活疫苗。另外，滅活疫苗抗原成分含量不高以及滅活過程中主要抗原決定簇丟失，因而常需要多次接種，而且應(yīng)用佐劑可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用，如食欲下降、高熱等。因此，滅活疫苗在預(yù)防效果上還有待進(jìn)一步提高。

4.2 豬偽狂犬病活疫苗

活疫苗與滅活疫苗相比，活疫苗能夠激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，整體保護(hù)力更強(qiáng)，免疫效果更佳。但活疫苗毒力不穩(wěn)定，有潛在的返強(qiáng)危險(xiǎn)。易在靶動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，形成潛伏感染的危害，應(yīng)激條件下能夠被激活，形成復(fù)發(fā)性感染并向外散毒的危險(xiǎn)［18］。

4.3 變異株疫苗

過去的幾十年，豬偽狂犬病疫苗Batha-K61 株在中國(guó)普遍使用，豬偽狂犬病的流行得到了有效的控制，但由于新型PRV 變異病毒的出現(xiàn)，中國(guó)豬群中PRV 感染情況日益惡化。眾多機(jī)構(gòu)開展了疫苗研制工作。田克恭團(tuán)隊(duì)研制了豬偽狂犬變異株滅活疫苗（HN1201-gE 缺失株）并在3 周齡的豬身上進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。所有接種疫苗的豬均存活，未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，且產(chǎn)生高水平的gB 和中和抗體，但未接種疫苗的豬均出現(xiàn)體溫升高和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，感染后6 d 內(nèi)死亡率為100%［19］。

4.4 以偽狂犬株為載體的重組疫苗

由于PRV 基因組龐大，具有較多的增值非必需基因和非編碼區(qū)，在這些區(qū)域缺失或插入外源基因不影響PRV 的復(fù)制，且以PRV 作為載體具有很多天然的優(yōu)勢(shì)，因此，開發(fā)PRV 為載體的重組二價(jià)或多價(jià)疫苗成為PRV 研究的一大熱點(diǎn)。但由于PRV屬于裂解感染型病毒，感染周期短導(dǎo)致重組病毒產(chǎn)生的蛋白量較少，所以，迄今為止還沒有一種以PRV 為載體的重組疫苗上市。

5 根除計(jì)劃

隨著對(duì)偽狂犬病流行病學(xué)特征、病毒致病機(jī)理研究的深入，尤其是基因工程標(biāo)記疫苗和配套鑒別診斷方法的推廣使用，偽狂犬病得到了較好的控制。在國(guó)際上，多數(shù)歐美和亞洲發(fā)達(dá)國(guó)家均已經(jīng)成功消滅了該病。中國(guó)在《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疾病防治規(guī)劃》（2012—2020 年）中已將PR 列為重點(diǎn)優(yōu)先防治動(dòng)物疫病之一。為深入落實(shí)有關(guān)目標(biāo)和要求，2014 年農(nóng)業(yè)部開展了動(dòng)物疫病凈化示范場(chǎng)和動(dòng)物疫病凈化創(chuàng)建場(chǎng)評(píng)估認(rèn)證。經(jīng)過幾年的努力，PRV 的控制和凈化技術(shù)得到了驗(yàn)證，中國(guó)豬群PRV 野毒感染情況已經(jīng)趨于穩(wěn)定。

6 結(jié)語

豬偽狂犬血清流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，自2012年以來中國(guó)各省都存在偽狂犬病毒流行，流行程度不一，不同地域之間的PRV 野毒感染程度差異大，豬不同生長(zhǎng)階段，偽狂犬病毒野毒感染率也不相同，這可能與取樣范圍和調(diào)查的區(qū)域有關(guān)。但從總體來看PRV 野毒感染呈下降趨勢(shì)。雖在2011 年以后中國(guó)出現(xiàn)了偽狂犬變異株流行，但國(guó)家很快便出臺(tái)了豬偽狂犬病的根除計(jì)劃，用gE 基因缺失疫苗與gE抗體檢測(cè)試劑盒配套使用，剔除野毒感染豬，并加強(qiáng)豬場(chǎng)生物安全措施、引種監(jiān)測(cè)、嚴(yán)防新毒株的傳入。對(duì)感染豬場(chǎng)在做好疫苗免疫接種的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)后備種豬的監(jiān)測(cè)，用陰性后備種豬逐步替換和淘汰陽性種豬，最終建立陰性種豬群，達(dá)到陰性種豬場(chǎng)的標(biāo)準(zhǔn)。目前，豬偽狂犬病得到了較好的控制，但是與發(fā)達(dá)國(guó)家相比依然有很大的差距。中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的養(yǎng)殖規(guī)模、模式和品種多種多樣，再加上地域廣闊，氣候、豬群健康水平不同，因此，疾病的凈化與根除需要各部門、各領(lǐng)域協(xié)同工作，將是一個(gè)系統(tǒng)而長(zhǎng)期的過程。