分子標記輔助選擇培育抗稻瘟病和抗褐飛虱多基因聚合的水稻恢復系

李進波，杜雪樹，夏明元，萬丙良，戚華雄

（湖北省農業科學院糧食作物研究所/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要的糧食作物，但在生長期間會受到許多病蟲害的為害，其中稻瘟病和褐飛虱是水稻的兩大主要病蟲害。目前，防治水稻稻瘟病和褐飛虱的主要途徑是使用化學農藥和種植抗性品種。但化學藥劑的使用會對自然環境造成污染、增加成本、增大稻谷中的農藥殘留量等，而種植抗病蟲品種既經濟有效又對環境友好。因此，培育具有多種抗性的水稻品種對于防治水稻稻瘟病和褐飛虱具有重要意義。

20 世紀60 年代中期，日本率先開展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，鑒定了最初的8 個抗性位點上的14 個基因，并建立了一套抗稻瘟病基因的鑒別體系。隨后，國際水稻研究所和中國等產稻國也逐漸開展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統性研究。截至2015 年3 月，已至少報道了69 個抗稻瘟病位點共84 個主效基因，24 個抗稻瘟病基因被成功克隆［1］。其中Pi1 和Pi2 基因是2 個顯性廣譜抗稻瘟病基因，對中國各稻區菌株表現為廣譜抗性，在抗稻瘟病抗性育種中具有重要的應用價值［2］。Pi1 被定位在第11 染色體長臂末端，與SSR 標記MGR4766 的遺傳距離為1.3 cM，研究表明MGR4766 對Pi1 進行選擇的準確率可達98%～100%［3］。Pi2 被定位在第6 染色體的短臂上，與SSR 標記AP22 的遺傳距離為1.2 cM［4］，研究表明AP22 對Pi2 進行選擇的準確率可達97%［5］。上述研究為利用分子標記輔助選擇Pi1 和Pi2 基因培育抗稻瘟病水稻品種奠定了基礎。

自20 世紀70 年代起，各國相繼開展了水稻褐飛虱抗性基因的發掘工作，截至目前，從秈稻和野生稻中至少鑒定了27 個抗褐飛虱基因［6］，為培育抗褐飛虱水稻品種奠定了基礎。Huang 等［7］從帶有藥用野生稻背景的滲入系B5 中鑒定了2 個顯性抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15，將它們分別定位在水稻第3 染 色 體 和 第4 染 色 體 上。 隨 后，Yang 等［8］將Bph15 基因定位于47 kb 范圍，并開發了一些與之緊密連鎖的SSR 標記。在這些研究的基礎上，利用分子標記輔助選擇技術將抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15 導入到雜交稻親本中，已經成功地選育出抗褐飛虱的雜交稻親本和雜交組合［9］。

R022 是湖北省農業科學院糧食作物研究所選育的攜帶抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15 的恢復系，以其姊妹系鄂恢108 為父本配制的雜交組合巨風優108（巨風2A/鄂恢108）于2015 年通過湖北省農作物品種審定委員會審定，但區域試驗抗性鑒定結果顯示巨風優108 稻瘟病抗性綜合指數為6.5，穗瘟損失率最高級9 級，高感稻瘟病。為了改良巨風優108 的稻瘟病抗性，本研究以R022 為輪回親本、GD7 為供體親本，通過分子標記輔助選擇技術將抗稻瘟病基因Pi1、Pi2 與抗褐飛虱基因Bph14、Bph15聚合，培育同時具有稻瘟病抗性和褐飛虱抗性的水稻恢復系和雜交組合。

1 材料與方法

1.1 材料

輪回親本R022 是湖北省農業科學院糧食作物研究所培育的抗褐飛虱恢復系，攜帶抗褐飛虱基因Bph14 和Bph15。供體親本GD7 是廣東省農業科學院水稻研究所培育的抗稻瘟病品種，攜帶抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2。

1.2 分子標記和檢測方法

利用分子標記MRG4766、AP22、76-2 和MS5分別檢測Pi1、Pi2、Bph14 和Bph15 基因，分子標記的引物信息和PCR 反應程序見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR 反應體系總體積為15 μL，包括1.5 μL 10×buffer，1.2 μL dNTPs（各2.5 mmol），引物各0.3 μL（10 μmol），1 U Taq DNA 聚合酶，50 ng 模板DNA，最后用dd H2O 補足至15 μL。Taq DNA 聚合酶和其他相關試劑均購自Takara（Dalian，China）公司。PCR 反應在GenAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）中進行，擴增產物用0.6% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結合銀染顯色檢測。

1.3 雜交和選擇程序

以R022 為母本、GD7 作父本雜交獲得雜交種F1，再以R022 作輪回親本連續回交3 次，然后自交4 次獲得BC3F5株系。在回交過程中從BC1F1開始用分子標記檢測抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2，選擇帶有Pi1 和Pi2 基因且農藝性狀偏向R022 的單株作父本。在BC3F2中選擇農藝性狀優良的株系逐株檢測Pi1 和Pi2 基因，選擇Pi1 和Pi2 基因純合的單株再檢測Bph14 和Bph15 基因。

1.4 雜交組合的配制

在BC3F4代選擇遺傳背景與R022 最接近的株系R650 作父本，與3 個不育系巨風2A、天豐A 和內香5A 分別配制雜交組合，同時輪回親本R022 與不育系配制對應的雜交組合。

表1 目標基因的引物信息和PCR 反應程序

1.5 稻瘟病抗性鑒定

在湖北省恩施州農業科學院稻瘟病自然鑒定圃對R022、R650 及相應的雜交組合巨風2A/R650、天豐A/R650、內香5A/R650、巨風2A/R022、天豐A/R022、內香5A/ R022 進行稻瘟病鑒定。

1.6 褐飛虱抗性鑒定

褐飛虱抗性鑒定采用苗期集團鑒定法，將R022、R650 及相應的雜交組合巨風2A/R650、天豐A/R650、內 香5A/R650、巨 風2A/R022、天 豐A/R022、內香5A/ R022 及感蟲對照品種Taichung Native1（TN1）催芽后的種子播在塑料盒中（60 cm×40 cm×10 cm），每處理1 行，播20 粒左右，行長20 cm，行距5 cm，正常水肥管理。待苗長至三葉一心時，每行取健壯一致的幼苗15 株用于接蟲鑒定。按每株10 頭2～3 齡若蟲接蟲，重復3 次。褐飛虱為稻田采集的混合群體，主要包含生物型Ⅱ，采集后在TN1 上飼養繁殖。當感蟲對照品種TN1 死苗率達95% 左右時，調查其他鑒定材料的苗情，根據死苗率評定抗性級別。評價標準為：死苗率≤1.0%，級別為0，免疫；死苗率在1.1%～10.0%，級別為1，高抗；死苗率在10.1%～30.0%，級別為3，抗；死苗率在30.1%～50.0%，級別為5，中抗；死苗率在50.1%～70.0%，級別為7，中感；死苗率≥70.1%，級別為9，感。

1.7 農藝性狀的考查

R650、R022 及相應的雜交組合巨風2A/R650、天豐A/R650、內香5A/R650、巨風2A/R022、天豐A/R022、內香5A/R022 種植在武漢市大田中，隨機區組排列，3 次重復，每重復小區長6.7 m，寬2.0 m，每小區插10 行，每行40 穴，株行距16.7 cm×20.0 cm，成熟后每小區取樣10 穴，分別考查株高、單株穗數、穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、千粒重、結實率等重要農藝性狀，剩余材料全部收割測產。

2 結果與分析

2.1 分子標記輔助選擇及目標基因純合系的獲得

利用與Pi1 和Pi2 基因緊密連鎖的SSR 標記MRG4766 和AP22 對抗性基因供體親本GD7 和受體親本R022 進行多態性分析。MRG4766 在供體親本中擴增產物片段較大，在R022 中擴增產物片段較小；AP22 在供體親本中擴增產物片段較小，在R022 中擴增產物片段較大，MRG4766 和AP22 在供體親本GD7 和受體親本R022 之間都具有多態性（圖1）。

圖1 抗性基因Pi1 和Pi2 的連鎖標記在BC1F1至BC3F1群體中的分離

分子標記輔助選擇結合回交育種按以下程序進行：供體親本與受體親本R022 雜交，鑒定F1真假雜種后與R022 回交。在BC1F1群體中，經分子標記檢測獲得同時帶有Pi1 和Pi2 基因的單株（圖1），從中選擇農藝性狀與輪回親本接近的單株作父本取混合花粉繼續與R022 回交得到BC2F1。經分子標記檢測獲得帶有Pi1 和Pi2 基因的單株，選擇農藝性狀與輪回親本相似的單株作父本取混合花粉繼續與R022 回交得到BC3F1。經分子標記檢測獲得帶有Pi1 和Pi2 基因的單株套袋自交，分單株收種后種植成BC3F2株系，插秧一周后對每個單株定株編號取葉片備用。在分蘗期和抽穗期比較株系與輪回親本R022 的性狀差異，從中選擇基本整齊一致、農藝性狀優良且與R022 最相似的10 個株系。在收種前對這10 個株系所有單株的Pi1 和Pi2 基因進行檢測，共獲得Pi1 和Pi2 基因均純合的單株48 個（圖2）。然后用分子標記76-2 和MS5 分別檢測這48 個單株的Bph14 和Bph15 基因，其中44 個單株的Bph14 和Bph15 基因均為純合（圖3），即獲得Pi1、Pi2 和Bph14、Bph15 這4 個基因都純合的單株44 個。最后從7 個株系中選擇50 個單株種植成BC3F4株系，經田間表型觀察這些株系的農藝性狀已基本穩定，通過田間農藝性狀的進一步比較，從BC3F4株系中選擇36 個單株形成BC3F5株系。根據BC3F5株系田間農藝性狀表現，綜合性狀優良的株系C650 入選，暫定名為R650。

圖2 抗性基因Pi1 和Pi2 的連鎖標記在BC3F2群體中的分離

圖3 抗性基因Bph14 和Bph15 的連鎖標記在BC3F2群體中的分離

2.2 稻瘟病抗性評價

在湖北省恩施州農業科學院稻瘟病自然鑒定圃對GD7、R022、R650 及相應的雜交組合進行稻瘟病鑒定，結果見表2。由表2 可知，R650 和供體親本GD7 表現為抗，而受體親本R022 表現為高感，R650的抗性明顯強于R022 的抗性。雜交組合巨風2A/R650、天豐A/R650、內香5A/R650 的抗性綜合指數在2.5～4.3，表現為中抗或中感；而巨風2A/R022、天豐A/R022、內香5A/R022 的抗性綜合指數在5.3～6.8，表現為中感或感，R650 配制的雜交組合的稻瘟病抗性明顯強于受體親本R022 配制的相應雜交組合的抗性，說明利用分子標記輔助選擇Pi1 和Pi2基因培育抗稻瘟病的恢復系和雜交組合是一種有效的途徑。

2.3 褐飛虱抗性評價

采用苗期集團鑒定法鑒定R650、R022 及其雜交組合的褐飛虱抗性，鑒定結果表明R650 和R022抗性為3 級，表現為抗，R650 和R022 配制的雜交組合的抗性為5 級，均表現為中抗，而對照TN1 的抗性為9 級，表現為感，說明通過回交轉育和分子標記輔助選擇Bphl4 和Bph15 基因，育成品種的抗性能保持輪回親本的抗性。R650 和R022 的抗性強于其雜交組合的抗性，說明Bphl4 和Bph15 基因在純合狀態下的抗性強于雜合狀態下的抗性。

2.4 農藝性狀考查

對R650、R022 及其雜交組合的主要農藝性狀進行了考查，結果見表3。由表3 可知，R650 的基本農藝性狀與R022 相似，雜交組合巨風2A/R650、天豐A/R650 和內香5A/R650 與對應的巨風2A/R022、天豐A/R022 和內香5A/R022 比較，在產量構成性狀上沒有明顯的差異，小區產量基本在同一水平。這說明通過分子標記輔助選擇選育的恢復系R650保持了輪回親本R022 的優良性狀，與不育系配制的雜交組合也保持了原有雜交組合的產量水平。

3 討論

為了保留輪回親本的優良性狀，在回交過程中可以使用分子標記進行背景選擇，通過選擇背景回復率高的個體參加下一代的回交，能加快受體遺傳背景恢復的速度。本研究在回交過程中沒有利用分子標記進行背景選擇，而是在每一次回交過程中選擇農藝性狀與輪回親本相似的單株作父本，以加快輪回親本遺傳背景的回復率，同樣能達到育種目標。

表2 稻瘟病抗性鑒定結果

表3 各材料農藝性狀表現

培育的恢復系R650 與不育系巨風2A 配制的三系雜交中秈稻新組合巨風優650 參加了2015—2016 年湖北省中稻品種區域試驗，2018 年完成了生產試驗，2019 年8 月通過湖北省農作物品種審定委員會審定。區域試驗抗性鑒定結果顯示，巨風優650 稻瘟病抗性綜合指數為2.4 級，穗瘟損失率最高級為3 級，中抗稻瘟病。進一步說明Pi1 和Pi2 基因在稻瘟病抗性育種中具有重要的應用價值。