基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的天南星抗癌機(jī)制研究

郝愛(ài)平，吳啟康，國(guó)會(huì)艷，薛巨坤，魏繼承，任如意

（牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

天南星（Arisaema consanguineum）是天南星科天南星屬植物。味苦辛，性溫，有毒；是臨床燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫的常用藥，外用治療癰腫及蛇蟲(chóng)咬傷［1］。近年來(lái)的研究表明天南星具有良好的抗腫瘤活性。戚笑笑等［2］利用H22 肝癌細(xì)胞皮下移植動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)天南星的體內(nèi)抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)天南星的醇提取液和水提取液均具有抗癌作用。楊宗輝等［3］通過(guò)研究中藥天南星提取物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞凋亡及其生化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)天南星提取物有誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞程序性死亡的作用，其生化機(jī)制可能是通過(guò)激活特定的傳導(dǎo)通路caspase 途徑實(shí)現(xiàn)的。張志林等［4］采用小鼠腋下接種腫瘤細(xì)胞法測(cè)定天南星醇提物的抗腫瘤活性，結(jié)果揭示了中藥天南星有可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫力來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤活性。張巖等［5］通過(guò)研究中藥天南星提取液對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞作用發(fā)現(xiàn)天南星醇提液和水提液對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，天南星醇提液抑制作用更為明顯。研究表明天南星的化學(xué)成分有凝集素類(lèi)、生物堿類(lèi)、苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)、甾醇類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、脂肪酸類(lèi)等。但是哪些化合物對(duì)于抗癌有作用以及天南星的抗癌機(jī)制目前尚不明確。

中藥存在“多組分，多靶點(diǎn)和協(xié)同作用”的特點(diǎn)，該特點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“多靶點(diǎn)”思想極為一致，所以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是研究中藥的好方法［6-8］。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)某種中藥材的研究、對(duì)中藥制劑的研究、對(duì)于中藥治療某些疾病的機(jī)制研究日益增多。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)并分析這些網(wǎng)絡(luò)中藥物，目標(biāo)和疾病之間的聯(lián)系［9，10］。有研究人員采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了莪術(shù)預(yù)防心血管和腦血管疾病的有效機(jī)制，同時(shí)預(yù)測(cè)了莪術(shù)的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)莪術(shù)是預(yù)防心血管和腦血管疾病的主要成分，梔子、麝香和冰片作為輔助藥物來(lái)輔助主要成分的作用，這些作用可能共同起到協(xié)同作用［11］。Xiang 等［12］運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)靈桂珠甘湯（LGZGD）治療第二代抗精神病藥物（SGAs）誘導(dǎo)的代謝綜合征（MetS）時(shí)發(fā)現(xiàn)JUN 是靈桂珠甘湯的推定靶標(biāo)，APOA1 是MetS 和SGAs的已知靶標(biāo)之一，LGZGD 可能抑制JUN，從而增加APOA1 的表達(dá)，通過(guò)一些重要途徑維持代謝穩(wěn)態(tài)。Hua 等［13］通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯的靶標(biāo)與鐵離子結(jié)合，造血，活性氧產(chǎn)生，細(xì)胞凋亡，炎癥和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以促進(jìn)鐵離子結(jié)合和造血活動(dòng)，抑制炎癥，產(chǎn)生活性氧，阻斷細(xì)胞凋亡，對(duì)貧血癥有顯著作用。綜上所述，研究人員可以有效利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)探究中藥的各種作用機(jī)制以及各種成分之間的相互作用并篩選出中藥重要的化合物、靶點(diǎn)以及通路。因此本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)天南星的活性化合物、抗癌靶點(diǎn)以及通路進(jìn)行分析，為今后進(jìn)一步揭示天南星的抗癌機(jī)制和抗癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 天南星活性成分的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.tcmsp.php），輸入研究材料的名稱(chēng)“天南星”，點(diǎn)擊“ingredients（成分）”根據(jù)閱讀文獻(xiàn)并結(jié)合研究材料的實(shí)際情況，本次研究將設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物半衰期（Drug half-life，HL）≥4 篩選并獲得需要研究的活性成分。

1.2 天南星抗癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的獲得

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.tcmsp.php）和閱讀文獻(xiàn)獲得天南星活性成分靶點(diǎn)。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Universal Protein）uniprot（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）對(duì)基因名稱(chēng)統(tǒng)一化后再與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌癥相關(guān)基因進(jìn)行映射；最終利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將收集到的龍葵抗癌靶點(diǎn)-基因名稱(chēng)統(tǒng)一化，并建立抗癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 天南星中活性成分抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用cytoscape3.7.1 來(lái)整理數(shù)據(jù)把節(jié)點(diǎn)繪制成便于觀看和研究的可視化網(wǎng)狀圖，以不同顏色的節(jié)點(diǎn)（node）表示藥效成分、潛在核心作用靶點(diǎn)及作用通路。邊（edge）用來(lái)連接某一藥效成分和其潛在作用靶點(diǎn)以及作用靶點(diǎn)和其注釋的相關(guān)通路。

1.4 天南星抗癌靶點(diǎn)互作及生物過(guò)程和通路富集分析

以STRING 平臺(tái)（https：string-db.org/）分析天南星抗癌靶蛋白的相互作用。使用ClueGO 軟件對(duì)抗癌靶點(diǎn)進(jìn)行生物過(guò)程分析。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//david. niaid. nih. gov）和ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）對(duì)抗癌靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 天南星中活性成分分析

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和閱讀文獻(xiàn)共找到天南星的48 種主要活性成分，選取與抗癌作用有關(guān)的活性成分有42 種（表1）。

2.2 抗癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)分析

通過(guò)閱讀文獻(xiàn)和使用uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)一共獲得了373 個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)其中有291 個(gè)靶點(diǎn)與抗癌作用有關(guān)，除去相同的靶點(diǎn)，共獲得65 個(gè)抗癌靶點(diǎn)（表2）。

2.3 天南星活性成分-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析

通過(guò)Cytoscape3.7.1 作圖（圖1）將抗癌靶點(diǎn)與化合物建立網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，以高度值（degree）≥10 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，高度值越大的化合物或基因說(shuō)明越重要。篩選出重要的化合物有松油醇（C5，Degree=14）、亞油酸（C7，Degree=11）、（8E，11E，14E）-8，11，14-二十二碳三烯酸甲酯（C18，Degree=12）、茚（C21，Degree=15）、2-甲基-5-丙基呋喃（C22，Degree=15）、表油菜素甾醇（C24，Degree=11）、1-乙酰基-B-咔啉（C29，Degree=14）、正戊基苯（C30，Degree=34）、2-甲基 苯并 呋喃（C35，Degree=21）。 重 要的靶 點(diǎn)有

ADH1B（Degree=10）、ADH1C（Degree=14）、LYZ（Degree=14）、PTGS2（Degree=19）、NCOA2（Degree=19）、CHRM1（Degree=10）、GABRA2（Degree=12）、CHRM2（Degree=10）、GABRA1（Degree=13）。以上研究表明天南星可能通過(guò)作用于這些基因發(fā)揮抗癌作用。

表1 天南星中潛在有效成分信息

表2 與抗癌有關(guān)的65 個(gè)靶點(diǎn)

圖1 天南星活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 抗癌靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

通過(guò)天南星抗癌靶點(diǎn)的靶蛋白互作圖（圖2）分析可以看出，有64 個(gè)蛋白有互作，PDE3A 與其他靶蛋白沒(méi)有相互作用關(guān)系。圖中共有64 個(gè)節(jié)點(diǎn)，255條邊，平均度為7.97。可以根據(jù)評(píng)分的多少，來(lái)篩選出哪些靶點(diǎn)之間的聯(lián)系更多、相互作用更強(qiáng)。以Sore≥0.990 的 有 PRF1、GZMB、RXRA、NCOA1、NCOA1、ESR1、RXRA、NCOA2、WNT3A、CTNNB1、NCOA2、ESR1、CTNNB1、CCND1、NCOA1、ESR2、ABCG8、ABCG5、ESR1、CCND1。 其 中 PRF1 和GZMB 之間的得分是0.999，RXRA 和NCOA1 之間、NCOA1 和ESR1 之間、RXRA 和NCOA2 之間的得分都是0.997，WNT3A 和CTNNB1 之間、NCOA2 和ESR1 之間、CTNNB1 和CCND1 之間的得分都是0.995，NCOA1 和ESR2 之間的得分是0.994，ABCG8和ABCG5 之間的得分是0，992，ESR1 和CCND1 之間的得分是0.990，因此以上這些靶點(diǎn)的抗癌作用相對(duì)強(qiáng)一些。

圖2 抗癌靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

2.5 抗癌靶點(diǎn)生物過(guò)程及通路富集分析

天南星抗癌靶點(diǎn)共調(diào)控12 個(gè)不同的生物學(xué)過(guò)程（圖3），包括活性氧合成過(guò)程、腺體形態(tài)發(fā)生、調(diào)節(jié)肌肉收縮、積極調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)類(lèi)固醇激素受體信號(hào)通路、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮、乙醇脫氫酶活性、鋅依賴(lài)性、對(duì)滲透壓的反應(yīng)、消化系統(tǒng)過(guò)程、化學(xué)突觸傳遞和百葉酸生物合成過(guò)程。類(lèi)固醇受體共激活因子3（SRC-3）基因在人肝癌組織的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，SRC-3 基因高表達(dá)與肝癌的臨床病理特征密切相關(guān)，SRC-3 可能成為潛在的肝癌分子標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)［14］。通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)的分析表明，天南星的抗癌靶點(diǎn)共有79 條通路。其中P＜0.05 的通路共有62 條。這些通路有一些與結(jié)直腸癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌有關(guān)。有些與細(xì)胞凋亡、癌癥中的蛋白多糖、癌癥的途徑、化學(xué)致癌作用、P53 信號(hào)通路、P13K-Akt 信號(hào)通路有關(guān)，這些通路間接起到抗癌作用。 通路分析氣泡圖（圖4）橫軸代表P，縱軸代表所選取的30 條重要通路。Rich factor 越大，表示富集的程度越大［15］。分析表明研究的關(guān)鍵靶蛋白主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥通路、癌癥中蛋白多糖通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、P53 信號(hào)通路等。

圖3 靶點(diǎn)GO 功能分析

3 小結(jié)與討論

圖4 通路氣泡圖

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多靶點(diǎn)研究思想，對(duì)新藥的研發(fā)有更深遠(yuǎn)的意義。本文通過(guò)建立天南星-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)松油醇、亞油酸、（8E，11E，14E）-8，11，14-二十二碳三烯酸甲酯、茚、2-甲基-5-丙基呋喃、表油菜素甾醇、1-乙酰基-β-咔啉、正戊基苯、2-甲基苯并呋喃等物質(zhì)的高度值高于其他化合物。重要的靶點(diǎn)有ADH1B、ADH1C、LYZ、PTGS2、NCOA2、CHRM1、GABRA2、CHRM2、GABRA1 等。有研究發(fā)現(xiàn)ADH1B 的基因多態(tài)性與食管癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)［16］。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）基因，已證實(shí)在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它是腫瘤、癌癥形成的促進(jìn)劑，且與多種繁殖性能，如排卵、胚胎移植、蛻膜、分娩等相關(guān)［17］。如PTGS2 負(fù)責(zé)炎癥和有絲分裂發(fā)生中涉及的前列腺素類(lèi)生物合成，與抗前列腺癌有關(guān)。PTGS2 多態(tài)性與中國(guó)東北地區(qū)肺癌的潛在原因有潛在的協(xié)同關(guān)聯(lián)［18］。PTGS2的多態(tài)基因編碼環(huán)氧合酶-2（COX-2），環(huán)氧合酶-2（COX-2）過(guò)度表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)［19］。NCOA2 是核受體輔激活因子2，NCOA2 不但可以促進(jìn)人胃癌細(xì)胞增殖及生存能力，還可通過(guò)抑制凋亡、促進(jìn)其轉(zhuǎn)移和侵襲作用增強(qiáng)細(xì)胞存活能力［20］。GABRA1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的異位過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的強(qiáng)烈抑制，GABRA1 和LAMA2 可能在大腸癌發(fā)生中起作用，并可能成為臨床上篩選和檢測(cè)大腸癌的潛在生物標(biāo)志物［21］。因此，天南星可能通過(guò)作用于以上抗癌靶點(diǎn)起到抗癌作用。通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)的分析表明，天南星的抗癌靶點(diǎn)共有79條通路。其中癌癥通路、TNF 信號(hào)通路、結(jié)直腸癌通路、小細(xì)胞肺癌通路、非小細(xì)胞肺癌通路、甲狀腺癌通路、前列腺癌通路、胰腺癌通路、子宮內(nèi)膜癌通路、細(xì)胞凋亡通路等與癌癥直接相關(guān)。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥中蛋白多糖通路、P53信號(hào)通路、P13K-Akt 信號(hào)通路、AMPK-ACC 信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路等與癌癥間接相關(guān)，這些通路間接起到抗癌作用。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）是一種多能性細(xì)胞因子，其與受體TNFR1 或TNFR2 結(jié)合后向下傳導(dǎo)的信號(hào)能夠決定細(xì)胞的生死存亡［22］。P53 可通過(guò)參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲等機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。P53 信號(hào)通路的抗癌作用還基于P53 是腫瘤抑制蛋白，能夠減輕正常細(xì)胞因生理逆境所帶來(lái)的的危害［23］。酪氨酸的代謝水平與乳腺癌有密切的關(guān)系，酪氨酸代謝水平低會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［24］。PI3K-Akt 信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲與遷移的調(diào)控［25，26］。AMPK-ACC 信號(hào)通路的激活在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮了促進(jìn)作用［27］。Ca2+信號(hào)通路通過(guò)介導(dǎo)DADS 誘導(dǎo)了人鼻咽癌CNE2 細(xì)胞凋亡［28］。蛋白多糖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與腫瘤血管的生成有關(guān)［29］。綜上所述，推測(cè)天南星主要通過(guò)ADH1B、ADH1C、PTGS2、NCOA2 等抗癌靶點(diǎn)參與上述通路起到抗癌作用，這為今后天南星抗癌機(jī)制的深入研究提供了理論依據(jù)。