明月草組培快繁技術體系的建立

楊利平，時 群，陳麗文，楊 瓊，李芳菲，程 愫

（1.欽州市林業科學研究所，廣西 欽州 535099；2.廣西財經學院，南寧 530003）

明月草（Angelica keiskei Koidzumi）又稱莖葉天葵，屬菊科菊三七屬（Gyunra），產自云南、貴州等地，印度、尼泊爾、緬甸、泰國也有分布［1］。明月草株高30～40 cm，直根系，主根肉質，側根多，莖直立，肉質、基部紫色帶綠，嫩莖淺綠色、具淺棱，被短柔毛或無毛，分枝力強，葉為單葉，互生，橢圓形或卵圓形，長10～12 cm，寬4～6 cm，邊緣有粗鋸齒，葉面綠色，葉背淺綠色，為宿根多年生長常綠直立草本植物。該物種含有多種天然活性物質，特別是富含特有物質查爾酮及香豆素，全草可入藥，具有增強人體免疫力、舒張血管、抑制胃酸分泌、抗血栓、降血糖、降血壓、抗組胺、防癌變等功效［2-5］。近年來，明月草又成為人們喜愛的一種蔬菜，主要食用莖葉，食法多樣，可炒食、炸食、涼拌、氽湯或做成茶汁，其具有獨特的芳香，可解魚、肉的腥膻味，莖葉煮水后食味柔滑，口感清爽［6，7］。

明月草以播種、分株或扦插繁殖方式為主，多在3～5 月進行，但受季節影響較大，且繁殖系數和出苗率低，難以滿足規模化生產需求［1，3］。組織培養繁殖速度快，所產種苗為脫毒苗，但國內利用組織培養技術繁育明月草的研究尚未見報道。本研究采用組織培養技術建立了明月草的組織培養再生體系，實現對明月草的規模化繁殖，并提供了一套高效的產業化栽培技術，為規模化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由欽州市林業科學研究所培育的2 年生且生長健壯、無病蟲害的明月草作為母株，剪取帶腋芽嫩枝作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 選取帶腋芽的嫩枝，去除葉片，先用自來水沖洗干凈，再用洗潔精清洗1 遍，然后用自來水沖洗4～5 遍，置于超凈工作臺上保留帶腋芽的莖段2～3 cm，切除其余莖段，設置為7 組處理，分別用0.1% HgCl2浸泡6、8、10 min；用75%C2H5OH 浸泡20、30、40 s，及75% C2H5OH 與0.1%HgCl2組合處理1 組（表1），每組處理設置30 個重復，每個處理接種1 條莖段，消毒后再用無菌水沖洗4 次，備用。外植體誘導培養基選用MS+0.20 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，同時附加30.0 g/L 蔗糖和3.6 g/L 瓊脂粉，pH 5.8。培養條件（下同）：培養溫度為（25±2）℃；光照度2 000～2 500 lx，光照時間為12 h/d。每隔3 d 觀察記錄1 次。

表1 明月草外植體消毒處理的設置

1.2.2 芽的誘導 將消毒好的莖段兩端各切除一部分，切成長1.5～2.0 cm，保留1 個節位，接入以MS 為基礎培養基，添加5 個梯度濃度的6-BA（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L）和3 個梯度濃度的NAA（0、0.05、0.10 mg/L）組合的5 組培養基中，選用未添加任何激素的空白MS 培養基為對照，每種誘導培養基接種30 個外植體。誘導培養基附加30.0 g/L 蔗糖和3.6 g/L 瓊脂粉，pH 5.8。每隔3 d 觀察1 次芽的萌動情況和生長情況，待培養至18 d 統計芽誘導率。

污染率=污染的外植體數/接種外植體數×100%；萌芽率= 萌發的外植體數/接種外植體數×100%；

有效芽率=萌發且未污染的外植體數/萌發的外植體數×100%。

1.2.3 增殖培養 待芽萌發至1.5 cm 左右時，切下接入以MS 為基礎培養基，并含有不同濃度6-BA和NAA 組合的培養基中（表2），同時設置空白對照，每個組合接種30 個外植體，進行增殖培養。每3 d 觀察1 次，培養15 d 后統計不同激素組合培養基對芽增殖和生長的影響，計算芽增殖系數。

增殖系數=增殖芽總數/接種芽總數。

表2 6 種不同激素種類及濃度增殖培養基組合

1.2.4 根的誘導 將生長至2.0 cm 左右的芽從叢生芽上切下，將單芽轉至以1/2MS 為基礎培養基，含有不同濃度IBA 和NAA 的生根培養基中，培養10 d 后調查生根情況，并記錄數據。

1.2.5 移栽管理 將長勢良好、生根較好的瓶苗煉苗2～3 d，移栽至裝有黃心土的薄膜袋中或泥炭土∶珍珠巖=4∶1 的穴盤中，在75% 遮陰度的溫室大棚中培養20 d 后觀察生長狀況和成活率。

1.3 試驗設計及統計方法

各組試驗均采用單因素完全隨機設計，對照均采用未添加任何植物生長調節劑的MS 空白培養基，每個處理設置30 個重復。運用DPS 15.1 軟件進行數據處理，LSD 法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 外植體不同消毒劑處理的差異比較

消毒是植物組織培養過程中的重要環節，本研究采用不同消毒方式探究最適宜明月草外植體消毒的方式。從表3 可以看出，分別采用0.1% HgCl2和75% C2H5OH 作為消毒劑，隨著0.1% HgCl2和75%C2H5OH 消毒時間的延長，可以有效降低外植體污染率，單一使用0.1% HgCl2消毒10 min 可以達到理想消毒效果，污染率控制在13.3%，萌芽率可達到83.3%，有效芽率達到96.0%。采用0.1% HgCl2和75% C2H5OH 兩步消毒，污染率可以得到較好的控制，但部分外植體失去萌發活力，有效芽較低。因此，最佳的消毒方式應采用單一0.1% HgCl2消毒10 min。

表3 不同消毒方式對明月草消毒效果的影響

2.2 不同激素配比對明月草芽誘導的影響

不同種類及濃度植物生長調節劑組合對明月草叢生芽誘導效果的對比試驗表明，隨著6-BA 濃度的增加，增殖系數有所提高，芽的初始萌動時間有不斷縮短趨勢，處理5 的培養基組合MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 與處理6 的培養基組合MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 效果最佳，增殖系數分別是3.34、3.36，均顯著高于其他培養基組合，綜合誘導效果和成本兩個方面，優選培養基組合MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 作為明月草的芽誘導培養基（表4），芽誘導效果見圖1。

表4 不同激素組合對明月草芽誘導的影響

圖1 明月草芽誘導培養

2.3 明月草最佳繼代增殖培養基的篩選

由表5 可知，在培養基中添加不同種類和濃度組合的激素后，明月草繼代增殖效果表現出一定差異，均優于空白對照組。供試培養基組合中，增殖效果最佳的一組（M6）增殖系數達到3.39，但該處理芽的生長狀態表現出細弱，長勢不佳；處理M5的增殖系數為3.22，顯著高于除了M6以外的其他組合。在培養基中添加0.20 mg/L 的腺嘌呤在一定程度上有助于促進芽的增殖；在繼代增殖階段，當6-BA 濃度達到0.80 mg/L 以上時不利于芽的生長。綜上所述，最適宜用做明月草繼代增殖的培養基組合為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.20 mg/L AD，增殖效果見圖2。

圖2 明月草增殖培養

2.4 不同濃度IBA 和NAA 組合對明月草組培苗生根誘導的差異比較

如表6 所示，處理2、處理3 及處理6 的培養基組合根誘導率均達到了100%；平均生根數最多的組合為處理2 及處理6，平均生根條數分別達到了7.40 條/株和7.70 條/株，且較其他處理達到了顯著性差異；從平均根長來看，處理2 和處理6 的生根效果最好，分別為4.90 和5.18 mm。綜合根誘導率、生根數量及根長3 個指標，最適宜明月草生根培養的培養基為1/2MS+0.40 mg/L NAA，其次為1/2MS+0.50 mg/L IBA，單一使用IBA 或NAA 的生根效果優于二者組合，生根培養見圖3。

表5 不同激素配比組合對明月草繼代增殖效果的影響

表6 不同濃度IBA 和NAA 組合對明月草組培苗生根誘導的差異比較

圖3 明月草生根培養

2.5 明月草試管苗的移栽及管理

明月草適于生長在疏松透氣、持水保肥性好的基質中，可選擇泥炭土與珍珠巖（4∶1）的基質作為移栽基質，亦可選用黃心土作為移栽基質，移栽前1 d需用0.1%KMnO4對基質進行消毒處理，移栽后澆透定根水，并用遮陽網覆蓋，或選用具有一定遮陰效果和通風條件的育苗棚。明月草生根瓶苗培養2 周左右，當生根條數達到6 條以上，平均根長在0.5 cm左右時便可煉苗3 d，然后用清水將根部瓊脂清洗干凈進行移栽。生根苗移栽后用清水淋透，移栽20 d后調查成活率。移栽試驗顯示，只要移栽時明月草的根系健壯，植株健康，管理得當，成活率可達到98% 以上（圖4）。明月草雖然感病性不強，但還是要預防為主，移栽后每隔2 周噴施適量1 000 倍多菌靈稀釋液，連續噴2～3 次。另外，因明月草生長迅速，需肥量大，可采用含氮、鉀較高、磷略少的全元控釋肥補充其肥分需求，當植株長至一定高度及時換盆。

圖4 移栽20 d 后的明月草組培苗

3 結論

目前中國乃至國際上對明月草的研究主要集中在其營養成分分析、有效成分的提取方法以及有效成分的藥理作用等方面，如李玲等［8］、尹偉等［9］、程蕾等［10］對明月草葉片中黃酮類化合物的提取工藝及抗氧化活性進行的研究分析表明，明月草中提取的黃酮類化合物具有還原和清除DPPH 自由基和超氧陰離子的能力；還有研究報道了明月草的食用價值及其有效成分的醫用價值［11-13］。而現有的研究中對明月草繁育技術及栽培技術的研究尚少。袁志章等［1］、陳奎禮等［4］對明月草的扦插繁育技術進行了研究，并得出不同類型枝條扦插生根率的差異，最高的為86.6%；同時還闡明了氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵元素的缺失對明月草生長的影響。本研究主要運用植物組培快繁技術建立了明月草的快速繁殖體系，該體系為提升明月草優質種苗繁育技術及進一步開發利用其有效成分提供了研究基礎。

研究表明，使用0.1% HgCl2消毒10 min 可以達到理想消毒效果，污染率控制在13.3%，萌芽率可達到83.3%，萌發的有效芽達到96.0%。培養基MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 與MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 作為明月草的啟動培養基，均可以達到理想的效果，但生產中可結合生產成本核算擇優選擇；最適宜用做明月草繼代增殖的培養基為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.20 mg/L AD，增殖系數分別是3.39，在培養基中添加0.20 mg/L 的腺嘌呤在一定程度上有助于促進芽的增殖；選用1/2 MS 培養基時，單一使用IBA 或NAA 的生根效果優于二者組合，且生根數及平均根長均優于其他處理組合；當NAA 濃度為0.4 mg/L 時，培養10 d，生根率可達到100%，而使用濃度為0.5 mg/L 的IBA亦可達到理想的生根效果，兩組之間不存在顯著差異。試驗中發現選用泥炭土與珍珠巖（4∶1）或黃心土作為移栽基質，均可達到理想的移栽效果，但綜合考慮生產成本，建議選用黃心土作為移栽基質。用黃心土作為移栽基質，在保證明月草組培苗根系完整的情況下，20 d 后調查成活率可達98% 以上。