PAM 細胞中豬MMP14 不同轉錄本檢測及其生物信息學分析

吳俊靜，萬緒玲，黃藏宇，喬 木，武華玉，梅書棋，彭先文

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.江夏區動物衛生監督所，武漢 430200）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性免疫抑制性疾病。PRRSV 具有嚴格的宿主和細胞嗜性，入侵宿主細胞依賴細胞特異性受體，如CD163［1］。PRRSV 只感染豬，不感染其他物種，且主要感染單核巨噬細胞系中分化完全的細胞，尤其是豬肺泡巨噬細胞（Porcine alveolar macrophages，PAM）。近年來國內外學者研究了PRRSV 的致病機制，取得了一些成果，但是PRRSV 的致病機制，尤其是其逃逸天然免疫、病毒與宿主互作等方面的分子機制還不清楚。

基質金屬蛋白酶（MMP，Matrix metallopeptidase）家族蛋白參與細胞外基質在正常生理過程中的分解，如胚胎發育、繁殖和組織重塑等。基質金屬蛋白酶14（MMP14）是MMP 蛋白大家族的膜型基質金屬蛋白酶（MT-MMP）亞家族成員之一，這個亞家族的每個成員都含有一個潛在的跨膜結構域，在細胞表面表達。MMP14 參與MMP2 的激活，在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用［2，3］，同時MMP14 也與血管生成有關［4］。有關豬MMP14 基因功能的研究較少，課題組在前期的PAM 細胞全轉錄組測序分析中發現MMP14 基因在PRRSV 感染前后的PAM 細胞中差異表達，且存在2 種不同的MMP14 轉錄本（XM_021098303.1 和NM_214239.2），推測該基因參與PRRSV 感染過程。因此本研究進一步分析了MMP14 的不同轉錄本在PRRSV 感染PAM 中的表達特征，為揭示PRRSV 感染宿主細胞的分子機制充實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 頭4～5 周齡的健康大白豬來自湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所示范豬場；PRRSV-WUH3 毒株來源于華中農業大學。PBS 緩沖液、RPMI 1640培養液、胎牛血清購自Gibico 公司；Invitrogen TRIzol 試 劑、Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒購自Thermo 公司；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試劑盒購自Takara 公司。

1.2 儀器

紫外微量分光光度計購自Nanodrop 公司；CO2培養箱購自Thermo 公司；普通PCR 儀購自Bio-Rad 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自Roche 公司；電泳儀、凝膠成像分析儀均購自北京市六一儀器廠。

1.3 PAM 細胞分離培養

選擇4～5 周齡的健康大白豬（PRRSV 等各病原檢測陰性），在干凈無菌的環境中屠宰取全肺，用PBS 緩沖液（加1% 青霉素和鏈霉素）分批次緩慢灌入肺中（400～500 mL），每次對灌滿的肺進行肺部按摩，并用吸管輕輕吹打，使其細胞團及黏液塊打散，用無菌紗布過濾收集灌洗液，1 600 r/min 離心10 min 收集細胞。收集的細胞用RPMI 1640 培養液（加1% 青霉素和鏈霉素）進行洗滌，1 600 r/min 離心10 min；重復洗滌1～2 次。將洗滌好的細胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養液重懸后，培養于10 cm 培養皿中，37 ℃、5% 的CO2培養2 h。除去未貼壁的細胞，余下細胞即可消化轉入需要的6 孔細胞培養板中進行后續試驗。分離的細胞用不完可以凍存，用細胞凍存液重懸細胞，進行分裝凍存。

1.4 PRRSV 感染

PAM 細胞貼壁培養過夜后，用0.5 MOI 劑量的PRRSV-WUH3 毒株感染PAM 細胞，吸附1 h 后，用含2% 胎牛血清的RPMI 1640 培養液繼續培養。感染24 h 后收集細胞，利用Trizol 消化細胞，提取細胞總RNA。對照組PAM 細胞用RPMI 1640 培養基替代PRRSV 毒株處理。

1.5 PAM 細胞總RNA 抽提與cDNA 制備

利用Trizol、氯仿法提取PAM 細胞總RNA。使用紫外微量分光光度計檢測RNA 樣品濃度與OD值，利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。取1 μg 的總RNA 樣本，利用Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒，參照試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA。

1.6 MMP14 不同轉錄本熒光定量檢測

根據GenBank 數據庫中豬MMP14 基因（登陸號為NC_010449.5）的2 種轉錄本（XM_021098303.1和NM_214239.2）cDNA 序列設計3 對引物，引物序列如表1 所示，其位置如圖1 所示。熒光定量PCR 采 用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試 劑盒，反應體系20.0 μL：qPCR mix 10.0 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，滅菌雙蒸水8.0 μL。利用Light-Cycler480 熒光定量PCR 儀，以β-actin 作為內參，進行熒光定量PCR 試驗，用2-ΔΔCt 法計算相對表達量，每組試驗做3 個平行，每個試驗重復3 次。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環40 次。

1.7 MMP14 不同轉錄編碼蛋白生物信息學分析

圖1 MMP14 不同轉錄本熒光定量檢測引物設計位置

表1 熒光定量PCR 引物序列

蛋白質跨膜螺旋采用在線工具TMHMM-2.0（https：//services. healthtech. dtu. dk/service. php？TMH MM-2.0）預測，蛋白的功能結構域采用CDD 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Pfam 數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）預測。

2 結果與分析

2.1 豬MMP14 基因不同轉錄本檢測結果

根據GeneBank 數據庫信息，豬MMP14 存在2個轉錄本分別是 XM_021098303.1 和 NM_214239.2，是MMP14 基因序列不同剪切導致的。XM_021098303.1 全長4 066 bp，由9 個外顯子序列拼接而成，CDS 編碼序列為1 785 bp，編碼594 個氨基酸的蛋白（登錄號為XP_020953962.1）。另一個轉錄本NM_214239.2 全長3 673 bp，由10 個外顯子序列拼接而成，CDS 編碼序列為1 743 bp，編碼580個氨基酸的蛋白（登錄號為NP_999404.2）。2 個轉錄本cDNA 序列最大的區別在于NM_214239.2 在XM_021098303.1 第3 個外顯子處剪切掉一段351 bp 的序列。

根據以上特征，本研究設計了3 對熒光定量PCR 引物，第1 對引物（MMP14-F1）只能擴增出XM_021098303.1 序列，第2 對引物（MMP14-F2）只能擴增出NM_214239.2 序列，而第3 對引物（MMP14-F3）2 種轉錄本均能擴增出來。在PRRSV感染24 h 后的PAM 細胞中，分別采用以上3 對引物檢測MMP14 不同轉錄本的表達情況，結果如圖2所示。 由圖2 可知，與未感染組（MOCK）相比，PRRSV 感染組MMP14 表達量整體下調，其中轉錄本NM_214239.2 表達量顯著下調（P＜0.05），而轉錄本XM_021098303.1 表達量卻極顯著上調（P＜0.01）。

圖2 豬PAM細胞中MMP14基因不同轉錄本定量檢測結果

2.2 豬MMP14 基因不同轉錄本編碼蛋白結構預測分析

轉錄本XM_021098303.1 編碼的蛋白為XP_020953962.1，由594 個氨基酸組成；另一個轉錄本NM_214239.2 編碼的蛋白為NP_999404.2，由580個氨基酸組成。2 種編碼的蛋白序列主要是前端序列有差異，如圖3 中下劃線區域的序列所示。利用生物信息學工具TMHMM-2.0 分析蛋白質跨膜螺旋結構區域，發現這2 種蛋白均具有明顯的跨膜功能區（圖4），說明2 種蛋白的序列差異并不影響蛋白的跨膜功能。在此基礎上，利用CDD 和Pfam 數據庫分析2 種蛋白的結構域，結果如圖5 所示。由圖5可知，2 種蛋白都具有MMP 蛋白家族的典型結構域，如基質蛋白酶（Peptidase_M10，Matrixin）和血紅蛋白樣重復結構（HX，Hemopexin-like repeats）。其主要區別是XM_021098303.1 編碼的XP_020953962.1 蛋白缺少1 個假定肽聚糖結合域（PG_binding_1，Putative peptidoglycan binding domain）。

圖3 MMP14 不同轉錄本編碼蛋白的氨基酸序列

圖4 MMP14 不同轉錄本編碼蛋白膜跨越區域預測結果

圖5 MMP14 不同轉錄本編碼蛋白功能結構域分析結果

3 小結與討論

MMP 家族是一類高度同源的鋅離子和鈣離子依賴肽鏈內切酶，以無活性的酶原形式進行表達，經過激活之后才具有酶活性。它以能夠降解多種細胞外基質組分和非基質蛋白質而聞名，是各種生物活性分子如趨化因子、促炎性細胞因子、絲氨酸蛋白酶和生長因子抑制劑等的重要調節因子，在許多生理過程中起著重要作用，如組織重塑、胚胎發育、傷口愈合以及組織防御機制和免疫應答等［5，6］。MMP14是發現的第一個膜型MMP，含有跨膜結構域，在細胞表面表達。與MMP 家族蛋白相同，MMP14 本身以酶原形式合成，經氟林蛋白酶樣蛋白水解酶活化，然后分泌至胞外表達于細胞膜上［7］。

本研究在PAM 細胞中鑒定了豬MMP14 基因的2 種不同轉錄本，并發現2 種轉錄本在PRRSV感染細胞后差異表達，且趨勢不同。PRRSV 感染后轉錄本NM_214239.2 顯著下調表達（P＜0.05），而轉錄本XM_021098303.1 卻極顯著上調表達（P＜0.01）。經過生物信息學分析后發現，豬MMP14 的2 種不同轉錄本編碼的蛋白均保留了跨膜的活性，這也與此類蛋白主要在細胞膜表面表達相符［2-4］。同時，基質蛋白酶、血紅蛋白樣重復結構等MMP 蛋白家族的典型結構均相同。MMP14 的血紅素域能和CD44 結合，與細胞內細胞骨架的重排、細胞遷移、侵襲以及MMP2 的激活有關［8］。

本研究發現轉錄本XM_021098303.1 編碼的XP_020953962.1 蛋白缺少1 個肽聚糖結合域（PG_binding_1），這個結合域由3 個螺旋組成，位于多種參與細菌細胞壁降解酶的N 或C 端。該結合域可能具有肽聚糖結合功能，在大部分MMP 蛋白家族中均存在，是N-末端催化領域的基質蛋白。研究發現該結合域與肽聚糖結合［9］，肽聚糖是人類免疫系統的免疫增強劑，能刺激單核吞噬細胞和內皮細胞釋放免疫調控物質，如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介 素（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12）、干擾 素α（IFN-α）等［10］。研究還發現MMP14 前肽結構域末端的RRKR 基序，能夠被弗林蛋白酶或者相關的前蛋白轉化酶水解，從而激活MMP14 蛋白前體［11，12］。XP_020953962.1 蛋白的前肽序列缺少RRKR 基序和PG_binding_1 功能區，可能導致MMP14 蛋白前體無法被活化，不具有降解細胞外基質等活性。PRRSV 感染細胞后，轉錄本NM_214239.2 下調表達而轉錄本XM_021098303.1 上調表達，可能會導致具有功能活性的MMP14 蛋白減少。MMP14 蛋白最主要的功能是促進細胞外基質降解，能水解多種細胞外基質組分和血清蛋白，如I 型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、載脂蛋白等；還可以脫落細胞表面生物分子，如CD44、多配體聚糖-1、E-鈣粘蛋白等；另外還可以水解細胞因子、趨化因子和生長因子等［13］。PRRSV 感染能夠誘導機體產生大量的炎性因子和趨化因子，而這些細胞因子在PRRSV感染所引起的先天性免疫反應以及炎性損傷中發揮重要的作用［14］，如PRRSV 感染后引起外周血單核細胞中趨化因子IL-8 的上調［15，16］，IL-8 等趨化因子在病毒感染所引起的炎性反應和免疫損傷中發揮重要作用［17］。Ait-ali 等［18］研究發現，PRRSV 感染能力較低的品種豬PMA 中，IL-8 分泌大量減少，細胞因子的合成以及分泌在PRRSV 感染引起的先天性免疫反應中也具有重要功能。綜上，推測PRRSV 感染后抑制MMP14 蛋白活性，與PRRSV 刺激細胞因子與趨化因子的大量表達相關。然而，MMP14 在PRRSV 感染中的具體作用還有待進一步研究。