初步對烏靈參丙酮提取物官能團和化合物分析

盧金 何文迪 馬少華 吳迪

(寧波衛生職業技術學院，浙江 寧波 315100)

烏靈參屬子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌，別名烏苓參、雞(土從)蛋，又名雷震子，主要產于江蘇、浙江、四川、云南、廣東、江西等地，生長在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上，是傳統的藥用真菌、食用菌，具有特殊的生物學特性、豐富的生理活性成分和廣泛的藥理作用，被世界藥用真菌研究、應用領域均視為珍稀、名貴藥材[1]。烏靈菌粉的鎮靜安神、抗失眠、抗抑郁、抗焦慮效果，在臨床上己經得到證實，顯示中醫藥在這方面的獨特優勢[2,3]。浙江佐力藥業以烏靈菌粉制造的烏靈膠囊被國家確定為“一類新藥”、“中藥保護品種”進入國家醫保目錄，是用于治療焦慮、抑郁和失眠等病癥的唯一單方型中藥制劑。

盡管烏靈參療效得到了認可，但因其生長環境奇特，自然資源采掘非常困難，使得野外采集的烏靈參樣品量有限，小分子化合物的分離純化報道較少，所以對其研究及推廣非常緩慢。目前，國內已有烏靈發酵菌絲生產的報道，烏靈參的應用才成為可能，從高等真菌中尋找新的藥物以及生理活性物質是目前國內外藥物研究的熱點，作為一個具有廣闊開發潛力的藥用真菌，目前在產品開發上也僅以其發酵粉面世，所以烏靈參應用開發才剛剛開始。

1 烏靈參微觀結構

圖1是新鮮烏靈參切片后用蘇木素伊紅聯合染色后，在光學顯微鏡下觀察到的圖片(放大1000倍)。從圖1可以看出，新鮮烏靈參內部由絲狀菌絲纏結組成，細胞壁較薄,細胞排列疏散且相互纏繞,菌絲細胞之間有大量的空隙，這應該是便于貯存空氣和水分。

圖1 新鮮烏靈參切片放大圖(放大1000倍)

圖2是用掃描電鏡觀察烏靈菌粉，可以看到其表面為復雜的無規則斷面結構，符合植物及真菌類粉碎后的特征。從圖2中可以看到菌粉表面有很多孔洞，這些孔洞的直徑小于1μm。這種結構與圖1在顯微鏡下觀察到的大量絲狀結構相一致。

圖2 烏靈菌粉表面掃描電鏡圖片

2 烏靈參提取物體制備

新鮮烏靈參子實體在45℃條件下烘干后破碎成粉末狀，然后用過80目篩子，利用超聲波細胞破碎儀對烏靈菌粉的醇分散懸濁液超聲破碎30min后，按照1∶10的料液比添加適量的80%丙酮，室溫下浸提12h，采用旋轉蒸發儀將浸提液濃縮成浸膏，即烏靈參丙酮提取物。

3 紅外吸收光譜、液相色譜初步分析烏靈參提取物的主要官能團

用索氏抽提器分別使用水和丙酮為介質對本研究團隊初步培養的烏靈參進行有效成分提取。用紅光光譜對烏靈菌粉做了定性檢測、用液相—質譜聯用儀對提取的有效成分進行分析，實驗數據見圖3至圖5。圖3是提取前的烏靈菌粉紅外光吸收譜，圖4是提取后的烏靈菌粉紅外光吸收譜，圖5是烏靈參提取液的液相色譜峰。由于烏靈參的成分比較復雜，用現有的質譜數據庫分析的結果與其它儀器的分析結果有偏差，所以現在以物質結構計算理論分析為主。目前，質譜測定的結果如下：最低質量是30D；最高質量是550D；第1個基團的第1個和第2個原子團的質量都是149D，這個基團中的質量分布為149D、167D、279D，保留時間均是30min；第2個基團的第1個原子團的質量是91D，第2個原子團的質量都是150D，這個基團中的質量分布為91D、149D、150D、206D，保留時間均是30min；第3個基團的第1個原子團的質量是149D，第2個原子團的質量都是150D，這個基團中的質量分布為149D、150D、167D、279D，保留時間均是30min；第4個基團的第1個原子團的質量是149D，第2個原子團的質量都是167D，這個基團中的質量分布為149D、150D、167D、279D、263D、293D、307D，保留時間均是30min。

圖3 提取前的烏靈參粉紅外光吸收譜

圖4 提取后的烏靈菌粉紅外光吸收譜

圖5 烏靈參提取液的液相色譜峰

4 烏靈參提取物有效成效分析

利用超聲波細胞破碎儀對烏靈菌粉的醇分散懸濁液超聲破碎30min后，用丙酮熱抽提，然后用氣相—質譜聯用儀分析烏靈參提取液中的有效成分。從離子出峰時間來看，烏靈參提取液含量較多的有4種成分。出峰時間約是：9.5min、10.9min、12.1min、15.0min之間。圖7至圖9是相關成分經過和數據庫比對得到的分析圖譜。分析結果表明，提取物的成分比較復雜，一些單體擁有獨特的2-甲酰基吡咯稠合嗎啉環的三環骨架，均為螺環吡咯生物堿，這些化合物在天然產物中非常稀少。其它小分子單體有：5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮(1)、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮(2)、5-羥基-2-甲基-4-二氫色原酮(3)、1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮(4)、5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(5)、麥角甾-7,22-二烯-3β-5α,6β-三醇(6)、大戟醇(7)、β-谷甾醇(8)、2-(4-羥基苯)-乙醇(9)、8-二羥基-3-甲基-3，4-二氫異香豆素等。另外，不能被提取的物質主要是多糖、腺苷、氨基酸、微量元素及蛋白質等。

圖6 (A～J)烏靈參提取液各官能團質譜圖

圖7 提取液中主要的離子分布出峰時間

圖8 14.007min離子峰對應的結構式

圖9 16.531min離子峰對應的結構式

烏靈參主要成分為腺苷、氨基酸、多糖、微量元素及蛋白等[4,5]。特別是氨基酸的種類異常豐富，構成人體蛋白質主要的20種a-氨基酸，烏靈參就有17種；人體本身無法自身合成8種必需氨基酸，烏靈參就有7種，并含有大量的谷氨酸和較多的賴氨酸[1,6]。1993年，有學者從烏靈參中分離獲得羧酸酯水解酶FE-Ⅰ、FE-Ⅱ、FE-Ⅲ和FE-Ⅳ。其中，FE-Ⅰ和FE-Ⅱ相對分子量約為78.5kDa，FE-Ⅲ和FE-Ⅳ約為78.5kDa，4種酶為同源二聚體，其亞基通過非共價鍵相連，酯酶活性較高[8]。

對于烏靈參所含的小分子單體成分研究，2001年，吳根福等從其深層發酵制品中獲得能捕捉DPPH自由基活性成分,推斷為5,8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素[9]。2008年，首次分離出5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮、5-羥基-2-甲基-4-二氫色原酮、大戟醇、1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮、β-谷甾醇、5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-二烯-3β-醇、麥角甾-7,22-二烯-3-β-5α,6β-三醇、2-(4-羥基苯)-乙醇等9個單體成分，其中化合物5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮為首次分離到的天然產物[22]。2015年，分離出2個新的化學單體xylapyrrosides A和B及2個已知化合物pollenopyrrosides A和B，均為螺環吡咯生物堿，2-甲酰基吡咯稠合嗎啉環的三環骨架是其獨特結構，在天然產物中極為少見[10]。此外，有研究報道顯示烏靈參還含有8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素成分[11]。