人表皮生長(zhǎng)因子受體 2陽(yáng)性乳腺癌患者程序性死亡受體配體 1和免疫組化標(biāo)志物表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系

陸娟，馮晨露，趙旭林

南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽(yáng) 473000

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率居中國(guó)惡性腫瘤第2位，病死率居中國(guó)惡性腫瘤第5位[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，乳腺癌的發(fā)病年齡趨于年輕化，且呈逐年遞增趨勢(shì)，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]。乳腺癌的分子分型包括三陰性、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性、Luminal A型、Luminal B型，約25%的乳腺癌患者為HER2陽(yáng)性乳腺癌患者，HER2陽(yáng)性乳腺癌通常表現(xiàn)出組織學(xué)分級(jí)高、分化程度低、增殖能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等惡性生物學(xué)行為，往往預(yù)后不良[3]。新輔助化療是HER2陽(yáng)性乳腺癌理想的治療手段之一，能夠改善患者的生存情況，但患者對(duì)化療的敏感性仍是臨床難點(diǎn)[4]。因此，尋找預(yù)測(cè)新輔助化療療效的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌個(gè)體化治療方案的選擇具有重要意義。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱 PD-L1）是一種跨膜糖蛋白，能夠阻止淋巴結(jié)中抗原特異性T細(xì)胞聚積，抑制淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞增生[5]。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TopoⅡα）是一種蛋白酶，與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、代謝等密切相關(guān)，是蒽環(huán)類藥物作用靶點(diǎn)之一[6]。細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67是一種能夠反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的核抗原，與腫瘤增殖、浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程相關(guān)[7]。研究報(bào)道，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌中異常表達(dá)，并與乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[8-10]。但Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)情況與新輔助化療療效的關(guān)系尚不清楚，本研究對(duì)其進(jìn)行了探討，以期為HER2陽(yáng)性乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年8月至2017年8月于南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院確診的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》中關(guān)于HER2陽(yáng)性乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②女性，單側(cè)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；③既往未接受手術(shù)、放療、化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等抗腫瘤治療；④接受了新輔助化療，方案包括環(huán)磷酰胺+表柔比星+5-氟尿嘧啶（CEF）方案、紫杉醇+表柔比星（ET）方案以及抗HER2藥物；⑤依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎功能障礙；②病歷資料不齊全；③合并血液系統(tǒng)疾??；④合并其他惡性腫瘤；⑤合并自身免疫性疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入93例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者，其年齡為25～75歲，平均年齡為（43.6±9.8）歲；≥60歲27例，＜60歲66例；月經(jīng)狀態(tài)：未絕經(jīng)18例，絕經(jīng)75例；腫瘤直徑：≤2 cm 41例，＞2 cm 52例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；組織學(xué)分級(jí)：1～2級(jí)24例，3級(jí)69例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期60例。收集所有HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的乳腺癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 主要儀器及試劑KD-1508A型組織切片機(jī)購(gòu)自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，二甲苯購(gòu)自上海繼錦化學(xué)科技有限公司，檸檬酸鈉緩沖液購(gòu)自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司，山羊血清購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，兔抗人Ki-67單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人TopoⅡα單克隆抗體購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司，兔抗人PD-L1單克隆抗體購(gòu)自蘇州派普泰克生物科技有限公司，羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購(gòu)自北京博爾西科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司，蘇木素購(gòu)自安徽永純生物技術(shù)有限公司，梯度乙醇購(gòu)自上海百由生物科技有限公司，中性樹(shù)脂固封劑購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，CX40型顯微鏡購(gòu)自寧波舜宇儀器有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況。具體方法：采用KD-1508A型組織切片機(jī)將其制作成厚度為4 μm的蠟塊連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，PBS漂洗，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，加山羊血清封閉，滴加稀釋比例為1∶200的兔抗人Ki-67單克隆抗體、稀釋比例為1∶200的兔抗人TopoⅡα單克隆抗體、稀釋比例為1∶200的兔抗人PD-L1單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，滴加稀釋比例為1∶1000的羊抗鼠IgG，37℃孵育20 min，PBS漂洗，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色5 min，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)脂固封劑封固。由兩位病理科醫(yī)師使用CX40型顯微鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞率和著色程度。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 Ki-67、TopoⅡα、PD-L1主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，將二者評(píng)分之積作為最終得分，0～3分判定為陰性，＞3分判定為陽(yáng)性。Ki-67、TopoⅡα、PD-L1均陽(yáng)性判定為Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達(dá)，否則為Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達(dá)[10]。

1.3 觀察指標(biāo)

比較Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況。采用Miler and Payne（MP）治療反應(yīng)評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)新輔助化療（不包括靶向治療）的療效，其中，1～2級(jí)判定為無(wú)效，3～5級(jí)判定為有效[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒狀（圖1）。Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.74%（63/93）、58.06%（54/93）、35.48%（33/93），分別明顯高于癌旁正常組織中的12.90%（12/93）、9.68%（9/93）、5.38%（5/93），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=58.112、48.606、25.929，P＜0.01）。

圖1 Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達(dá)情況的比較

不同年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡα、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組織學(xué)分級(jí)為3級(jí)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率均高于組織學(xué)分級(jí)為1～2級(jí)、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.065、18.810、12.205，P＜0.05）。組織學(xué)分級(jí)為3級(jí)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者乳腺癌組織中TopoⅡα的陽(yáng)性表達(dá)率均高于組織學(xué)分級(jí)為1～2級(jí)、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.618、9.893、11.885，P＜0.05）。組織學(xué)分級(jí)為3級(jí)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率均高于組織學(xué)分級(jí)為1～2級(jí)、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.172、10.665、13.990，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1的陽(yáng)性表達(dá)情況（ n=93）

2.3 乳腺癌組織中Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達(dá)情況與新輔助化療療效的關(guān)系

不同Ki-67、TopoⅡα、PD-L1表達(dá)情況乳腺癌患者的新輔助化療療效比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達(dá)的乳腺癌患者新輔助化療有效的比例明顯高于Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達(dá)的乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.341，P＜0.01）。（表2）

表2 不同Ki-67、TopoⅡ α、PD-L 1表達(dá)情況乳腺癌患者的新輔助化療療效（ n=93）

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，已成為危害婦女健康的常見(jiàn)惡性腫瘤。據(jù)調(diào)查，中國(guó)每年新增乳腺癌患病病例約26.9萬(wàn)，乳腺癌死亡病例約7.1萬(wàn)[11-13]。HER2陽(yáng)性乳腺癌約占全部乳腺癌的25%，該分型的乳腺癌分化程度低，增殖、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移能力高，多預(yù)后不良。新輔助化療是HER2陽(yáng)性乳腺癌綜合性治療中的重要手段之一，對(duì)患者病情具有一定的改善作用，但HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性仍是臨床亟待解決的難題。HER2陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因的生物學(xué)過(guò)程，其分子生物學(xué)機(jī)制復(fù)雜，因此，尋找預(yù)測(cè)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者新輔助化療療效的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要臨床指導(dǎo)意義。

PD-L1又稱B7同源體1（B7 homolog 1，B7-H1）或表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274），是免疫球蛋白超家族單體型Ⅰ型跨膜糖蛋白，大小為40 kD，由CD274基因編碼，由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)、跨膜區(qū)組成，廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。PD-L1能夠與細(xì)胞程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）結(jié)合，傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，阻止淋巴結(jié)中抗原特異性T細(xì)胞聚積，抑制淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞增生[14-16]。有研究顯示，PD-L1在惡性黑色素瘤、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)上調(diào)，提示PD-L1與惡性腫瘤的發(fā)病及病情進(jìn)展有密切聯(lián)系[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高，且與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期情況有關(guān)，提示PD-L1與HER2陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。TopoⅡα是一種蛋白酶，存在于原核生物和真核生物中，能夠調(diào)節(jié)DNA空間構(gòu)象，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組、代謝，是蒽環(huán)類化療藥物作用靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高，這與Shuai[18]的研究結(jié)果一致，結(jié)果顯示，其表達(dá)情況與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期情況有關(guān)，提示TopoⅡα與HER2陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。核抗原Ki-67與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，在有絲分裂中可維持DNA規(guī)則結(jié)構(gòu)，還與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，能反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。Ki-67表達(dá)上調(diào)高則提示細(xì)胞增殖活躍。本研究顯示Ki-67在HER2陽(yáng)性乳腺癌中呈高表達(dá)，這與相關(guān)研究的結(jié)果[19]一致，其表達(dá)水平與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期情況有關(guān)，提示Ki-67與HER2陽(yáng)性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本研究顯示Ki-67、TopoⅡα、PD-L1共表達(dá)的乳腺癌患者新輔助化療療效有效比例明顯高于Ki-67、TopoⅡα、PD-L1非共表達(dá)的乳腺癌患者，提示Ki-67、TopoⅡα、PD-L1聯(lián)合檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者新輔助化療療效，從而指導(dǎo)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者個(gè)體化治療。

綜上所述，Ki-67、TopoⅡα、PD-L1在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高，其表達(dá)情況與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及新輔助化療療效有關(guān)。但本研究納入的病例數(shù)量較少，研究時(shí)間較短，且其機(jī)制尚不清楚，故有待進(jìn)一步研究。