轉染葡萄糖神經酰胺合成酶小干擾RNA的胃癌細胞株SGC7901、SGC7901/DDP凋亡觀察

張俊杰，葛艷麗，王聲樂，王喆，王志榮

同濟大學附屬同濟醫院，上海200065

胃癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。化療是進展期胃癌主要的治療手段，但腫瘤細胞往往存在多藥耐藥(MDR)，是腫瘤化療失敗的主要原因，對胃癌MDR的研究一直是一個熱點。腫瘤細胞MDR的機制非常復雜，由MDR-1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)通過細胞外信號調節激酶(ERK)通路介導是MDR的主要機制之一[2-3]。研究[4-6]表明，葡萄糖神經酰胺合成酶(GCS)與多種腫瘤細胞的MDR密切相關，在腫瘤細胞MDR中的作用漸受重視。但有關胃癌細胞MDR的過程中GCS的作用及機制研究較少。2013年6月1日～2016年12月31日，本研究觀察了轉染GCS小干擾RNA的胃癌細胞株SGC7901、順鉑耐藥胃癌細胞株SGC7901/DDP凋亡情況，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞分組及SiRNA轉染 SGC7901及GES-1細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，5%CO2、37 ℃條件下飽和濕度培養。SGC7901/DDP細胞培養條件與SGC7901細胞相同，另在培養基中加入500 ng/mL順鉑，逐漸遞增順鉑劑量至800 ng/mL作為維持耐藥劑量，并在實驗前脫藥培養兩周。各細胞長滿后使用0.25%胰蛋白酶消化液消化、傳代，取對數生長期各細胞分為6組，分別記為GES-1組、GES-1+SiRNA組、SGC7901組、SGC7901+SiRNA組、SGC7901/DDP組、SGC7901/DDP+SiRNA組。取各組細胞，胰酶消化后以1×105個細胞鋪至6孔板中，待細胞貼壁后，GES-1+SiRNA組、SGC7901+SiRNA組、SGC7901/DDP+SiRNA組細胞采用脂質體2000轉染GCS SiRNA，GES-1組、SGC7901組、SGC7901/DDP組細胞轉染陰性對照GCS SiRNA，各組細胞繼續培養48 h后，收集對數生長期各組細胞用于實驗。

1.2 各組細胞凋亡指數測算 取各組細胞，使用PBS重懸，并計數。取1×105個細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入500 μL稀釋的1×Annexin V Binding buffer工作液重懸細胞。在細胞懸液中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置20 min，使用流式細胞儀檢測凋亡細胞數，計算凋亡指數?！?br>