祛痰清瘀方通過抑制ERK-LATS-YAP 信號緩解糖尿病大鼠大血管并發癥的臨床研究

寇鑫暉 趙恒俠 陳軍 李惠林

糖尿病大血管病變是發生于主動脈、冠狀動脈、腦基底動脈和腎動脈等處的動脈粥樣(AS)硬化性疾病,糖尿病顯著增加大血管并發癥的發生率［1］。正常生理狀態下,血管內皮細胞處于靜息狀態,內皮細胞僅在周圍細胞正常凋亡后短暫進入增殖狀態；而糖尿病病理狀態下,由于血液中ox-LDL 的刺激使得內皮細胞異常活化,并持續進入病理性增殖狀態,導致內皮功能紊亂［2］。血管內皮細胞活化和功能紊亂是AS 硬化性疾病的始動因素,過度的內皮細胞增殖是血管重構的一個重要因素［3］。如何抑制血管內皮細胞病理性活化和增殖一直是近年的研究熱點。近期多項研究［4］證實,YAP 蛋白在血管內皮細胞活化和增殖方面發揮重要作用。本文通過ox-LDL 刺激HAoEC 構建AS 病理模型,闡述祛痰清瘀方對ox-LDL 誘導HAoEC 活化和增殖的抑制作用及其抑制YAP 活化的潛在機制,并在動物模型中進一步驗證療效,為該方在臨床中用于防治糖尿病大血管病變提供更加充分的科學依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物 12 周齡雄性SD 大鼠60 只,平均體重(250±20)g,實驗操作符合《廣東省實驗動物管理條例》。

1.1.2 細胞 HAoEC 購于美國Lonza。

1.1.3 藥物和試劑 祛痰清瘀方組方：熟地15 g、當歸15 g、赤芍10 g、川芎10 g、紅花10 g、桃仁9 g、半夏15 g、橘紅15 g、白茯苓9 g、甘草4.5 g、地龍10 g,購于本院,制成含生藥2 g/ml 的濃縮液。內皮細胞生長培養基(EGM-2)購于美國Lonza；TG、TC、LDL-C、HDL-C 膽固醇試劑盒購于南京建成；CCK8 試劑購于日本同仁；所有抗體購于美國CST。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 通過喂飼含蔗糖20%、豬油10%、TC 3%、膽酸鹽1%的高脂飼料結合腹腔注射35 mg/kg STZ 建立大鼠糖尿病模型。將大鼠隨機分為對照組、模型組、祛痰清瘀方組(2.5 g/kg)、辛伐他汀組(20 mg/kg),各10 只。灌胃給藥1 次/d。

1.2.2 含藥血清 給予大鼠0.5 g/100 g 藥物灌胃7 d。動脈采血制備血清,56 ℃滅活30 min。

1.2.3 細胞實驗 以20 mg/L ox-LDL 刺激HAoEC 建立活化增殖模型,分為對照組、ox-LDL 組和ox-LDL+祛痰清瘀方組,各6 只。細胞以3×105/ ml 濃度傳代于6 孔板。給藥組以培養基+10%含藥血清處理。

1.2.4 糖脂含量測定 動物禁食12 h,在尾動脈測定FG。腹主動脈采血制血清,以試劑盒測定血清TG、TC,LDL-C 和HDL-C 的濃度。血管組織以氯仿甲醇(1∶1)提取3 d,提取液吹干,無水乙醇定容,試劑盒測定脂質含量。

1.2.5 Western blot 蛋白定量 裂解液蛋白配平,煮沸變性。以20 μg 蛋白電泳分離,并電轉至PVDF 膜。一抗室溫孵育2 h,二抗室溫孵育1 h,充分漂洗。電化學發光法(ECL)發光定量蛋白。

1.2.6 qPCR 裂解液提取RNA,逆轉錄制備cDNA。聚合酶鏈式反應(PCR)定量CTGF、CYR61 和ANKRD1 mRNA 表達量,以GAPDH 為內參,以2-ΔΔCt法計算待測mRNA 在各組中的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠血糖和血脂水平比較 模型組大鼠血清FG、TG、TC、和LDL-C 水平均顯著高于對照組,HDL-C 水平低于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組大鼠血清TG 水平顯著高于祛痰清瘀方組,差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組大鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均顯著高于辛伐他汀組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組大鼠血糖和血脂水平比較(,mmol/L)

表1 四組大鼠血糖和血脂水平比較(,mmol/L)

注：與對照組比較,aP＜0.01；與祛痰清瘀方組比較,bP＜0.05；與辛伐他汀組比較,cP＜0.05

2.2 四組大鼠主動脈脂質含量比較 模型組大鼠主動脈TG 和TC 含量均顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異有統計學意義(P＜0.01 或＜0.05)。見表2。

表2 四組大鼠主動脈脂質含量比較(,μmol/g)

表2 四組大鼠主動脈脂質含量比較(,μmol/g)

注：與對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組比較,aP＜0.01,bP＜0.05

2.3 四組大鼠內皮YAP 表達水平和ERK1/2 磷酸化水平比較 模型組大鼠主動脈中YAP 的表達水平及ERK1/2 的磷酸化水平均顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 四組大鼠內皮YAP 表達水平和ERK1/2 磷酸化水平比較(,對照組倍數)

表3 四組大鼠內皮YAP 表達水平和ERK1/2 磷酸化水平比較(,對照組倍數)

注：與對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組比較,aP＜0.01

2.4 五組HAoEC 增殖速率比較 ox-LDL 組增殖速率均高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,低于祛痰清瘀方+ERK 過表達組,差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 五組HAoEC 增殖速率比較(,對照組倍數)

表4 五組HAoEC 增殖速率比較(,對照組倍數)

注：與對照組、祛痰清瘀方組、辛伐他汀組及祛痰清瘀方+ERK 過表達組比較,aP＜0.01

2.5 五組細胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比較ox-LDL 組細胞中LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平顯著低于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,Erk1/2 的磷酸化比例顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異均有統計學意義(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 過表達組LATS1/2 和YAP 的磷酸化水平低于祛痰清瘀方組,差異均有統計學意義(P＜0.01)；各組MST1/2 磷酸化水平比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

2.6 五組細胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1表達水平比較 ox-LDL 組細胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達水平顯著高于對照組、祛痰清瘀方組和辛伐他汀組,差異均有統計學意義(P＜0.01)；祛痰清瘀方+ERK 過表達組YAP 靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表達水平顯著高于祛痰清瘀方組,差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表5。

圖1 五組細胞中LATS1/2 和YAP 磷酸化水平比較(n=6)

表5 五組細胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達水平比較(,對照組倍數)

表5 五組細胞中YAP 靶基因CTGF、CYR61 和ANKRD1 表達水平比較(,對照組倍數)

注：與對照組、祛痰清瘀方組、辛伐他汀組,aP＜0.01；與祛痰清瘀方組比較,aP＜0.01

3 討論

糖尿病人群AS 硬化性疾病患病率顯著高于非糖尿患者群 。大血管病變是糖尿病主要死亡因素［5］。目前臨床上主要通過他汀類防治糖尿病大血管病變,療效確定,但該類藥物常引起肝功能異常、肌病,導致部分患者無法堅持治療［6］。開發能夠改善患者生存的新型中藥制劑,具有廣闊的臨床前景。研究顯示,桃紅四物湯和二陳湯能夠改善糖尿病合并AS 硬化性疾病患者的臨床指標［7］。復方制劑祛痰清瘀方由桃紅四物湯和二陳湯化裁而成,其中,改白芍為赤芍,以加強活血祛瘀之力,同時加入地龍以進一步增強活血祛瘀的功效。

糖尿病造成的脂代謝紊亂顯著增加血液中脂質氧化產物的水平。ox-LDL 被細胞表面受體CD36 識別后經過復雜的信號轉導過程活化下游信號分子Erk1/2,進一步激活YAP［8］。活化的內皮細胞啟動增殖及轉化程序導致血管病理性重構［9］。YAP 是一個近年才被鑒定出的AS 硬化性疾病致病基因［3,4］。ox-LDL 激活YAP,引起YAP 發生核轉位［10］。YAP 的活性除受制于Hippo 信號外,還能被一些絲裂原信號活化,例如Erk1/2 信號［11］。Erk1/2 通過激活YAP,啟動內皮細胞增殖過程。活化的血管內皮細胞誘導單核/巨噬細胞停留于內皮下空間,并在這里吞噬脂質,形成脂質過載的泡沫細胞［12］。

本研究中,課題組觀察到ox-LDL 濃度依賴性激活體外培養HAoEC 中的YAP,祛痰清瘀方能夠抑制ox-LDL 對YAP 的活化作用,然而在對信號通路的研究中發現,ox-LDL 及祛痰清瘀方并不影響YAP 經典信號轉導過程中上游蛋白MST1/2 的活性,提示ox-LDL 及祛痰清瘀方可能通過其他途徑影響YAP 活性。課題組接下來檢測了可影響YAP 活性的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號。結果發現ox-LDL 通過絲裂原信號Erk1/2 激活內皮細胞中的YAP 蛋白,祛痰清瘀方則抑制Erk1/2 的活性。為了驗證此結果,課題組進一步過表達Erk2 蛋白,發現過表達Erk2 能顯著活化YAP,同時抵消祛痰清瘀方抑制YAP 活性的作用。

綜上所述,祛痰清瘀方通過干擾絲裂原信號轉導蛋白Erk1/2,阻礙YAP 活化,抑制內皮細胞病理性增殖介導的糖尿病大血管病變。