楊梅素-丙烯醛加合物抗氧化及捕獲丙烯醛活性

盧永翎，章鼎敏，肖留榜，呂麗爽,*

（1.南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023；2.南京曉莊學院共青團南京曉莊學院委員會，江蘇 南京 211171）

丙烯醛是一種具有高活性的不飽和醛，廣泛存在于各種食品中，如香腸[1]、肉排[2]、酒精性飲料[3]、油炸植物油[4]、甜甜圈[5]等，其含量范圍為10～11 300 μg/kg[6]。食品中的丙烯醛主要來源于油脂過氧化反應[7]和美拉德反應[8]。內源性脂質過氧化和多胺代謝也會產生丙烯醛[9]。2017年世界衛生組織國際癌癥研究機構已將丙烯醛列入三類致癌物[10]，長期吸入或通過飲食攝入富含丙烯醛的食物會誘發心血管疾病、糖尿病、肺癌、腎病、阿爾茨海默癥[11-15]，同時丙烯醛具有較高的細胞毒性，可導致DNA損傷，引起細胞凋亡[16]。因此，抑制食品中丙烯醛的形成，減少其對人體健康的危害具有研究價值。

楊梅素是一種多羥基黃酮醇類化合物，廣泛存在于楊梅科、葡萄科、豆科、菊科等植物中，具有很強的抗氧化活性[17]，歐美國家已將其應用于食品、醫藥、保健品及化妝品。本實驗室前期研究表明楊梅素具有很高的丙烯醛清除活性，其作用機制為捕獲丙烯醛形成加合物，并制備得到了楊梅素與丙烯醛的一加合物（mono-acrolein，MA）和二加合物（di-acrolein，DA-1）（圖1）。通過對該加合物進行理化分析，發現其具有非常高的熱穩定性和酸堿穩定性，由此引發對其性能的進一步探討。目前多項研究報道了黃酮類化合物如槲皮素[18]、根皮素[19]、橙皮素[20]等具有捕獲丙烯醛并形成相應加合物的能力，但有關黃酮-丙烯醛加合物的穩定性、安全性和功能活性鮮有研究[21]，國外多篇綜述也提出黃酮加合物的研究存在空區[22]。鑒于MA和DA-1結構中B環依然存在碳負離子（C-2’、C-6’）活性位點及多個酚羥基（C-3’、C-4’、C-5’）活性位點[23]，推測加合物可能依然具有丙烯醛清除活性及抗氧化活性。本實驗基于楊梅素加合物的結構特點，結合楊梅素應用于食品中的后續變化，擬對楊梅素與丙烯醛的加合物進行功能活性評價。

圖1 楊梅素（A）、MA（B）和DA-1（C）的結構Fig.1 Structures of myricetin (A) and MA (B) and DA-1 (C)myricetin adducts

本實驗對照楊梅素考察了MA和DA-1的總還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、油脂抗氧化能力；研究MA和DA-1捕獲丙烯醛的活性，以及在卵白蛋白-葡萄糖模型體系中，菜籽油熱處理和蛋糕實際體系中對丙烯醛形成的抑制效率，為研究楊梅素及其加合物在食品加工過程中抑制丙烯醛的作用機制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MA和DA-1（純度均≥95%）由南京師范大學食品化學實驗室自制；未添加抗氧化劑的菜籽油、低筋面粉、復合膨松劑、雞蛋、砂糖為市售。

楊梅素（純度為97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙烯醛（質量分數98%） 山東西亞化學工業有限公司；2,4-二硝基苯肼鹽酸鹽（純度＞98%）日本東京化成工業株式會社；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、卵白蛋白美國Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1260 高效液相色譜儀 美國Agilent公司；743 Rancimat油脂氧化儀 瑞士Metrohm公司；UV-6100A紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；CentriVap離心濃縮儀 美國Labconco公司；HH-S恒溫油浴鍋金壇市醫療儀器廠；BUD 302攪拌機、YXP 101-2商用電烤爐 上海早苗食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1的抗氧化活性測定

1.3.1.1 總還原能力的測定

參照羅磊等[24]的鐵氰化鉀法并稍作修改。量取1.0 mL不同濃度（0.01、0.05、0.1、0.5 mmol/L）的MA、DA-1、楊梅素、VC的甲醇溶液，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 6.6）和2.5 mL 1.0 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液，漩渦混勻后在50 ℃水浴中反應20 min，加入2.5 mL 10.0 g/100 mL的三氯乙酸溶液，混勻，10 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液，加入5.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.1 g/100 mL的FeCl3溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度。以甲醇溶液作為空白，VC作為陽性對照。

1.3.1.2 DPPH自由基清除率的測定

參照Goupy等[25]的方法并稍作修改。量取3.0 mL的DPPH溶液（0.2 mmol/L，溶于乙醇中），分別加入不同濃度（0.01、0.05、0.1、0.5 mmol/L）的MA、DA-1、楊梅素、VC的乙醇溶液1.0 mL，漩渦混勻，室溫避光靜置30 min，以無水乙醇調零，于517 nm波長處測定吸光度A1；同時測定1.0 mL不同濃度的樣品溶液與3.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm波長處吸光度A2；測定1.0 mL空白樣品與3.0 mL DPPH的混合液在517 nm波長處的吸光度A0。以VC作為陽性對照，按公式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.3.1.3 油脂抗氧化能力的測定

參照Wang Jun等[26]的方法，分別稱取5.0 g未添加抗氧化劑的菜籽油于Rancimat油脂氧化穩定性測定儀的反應池中，再分別添加MA、DA-1、楊梅素使其最終濃度均為1.0 mmol/L，以未添加樣品的菜籽油組作為空白對照，超聲10 min使其完全溶解。分別量取50.0 mL超純水于對應的測量池中，設置空氣流速為20 L/h，溫度為180 ℃，測定菜籽油的誘導時間/min。

1.3.2 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1抑制丙烯醛的活性測定

1.3.2.1 楊梅素與丙烯醛加合物捕獲丙烯醛能力的測定

量取濃度為0.5 mmol/L的丙烯醛溶液0.5 mL（由0.1 mol/L、pH 7.0的PBS配制），分別加入0.5 mL不同濃度的MA、DA-1、楊梅素溶液（0.05、0.10、0.25、0.50 mmol/L），漩渦混勻，100 ℃反應30 min，參考本實驗室方法[18]，取0.5 mL反應液，以2,4-二硝基苯肼為衍生化試劑，高效液相色譜法測定丙烯醛的含量Aj，用PBS代替楊梅素及其加合物作為對照測定丙烯醛含量Ai，按公式（2）計算對丙烯醛的抑制率。

1.3.2.2 楊梅素與丙烯醛加合物對卵白蛋白-葡萄糖模型中丙烯醛形成的影響

用0.05 mmol/L、pH 8.0的PBS配制卵白蛋白、葡萄糖溶液，在耐高溫玻璃瓶中依次加入2.5 mL卵白蛋白溶液（質量濃度8.0 mg/mL）、1.25 mL葡萄糖溶液（質量濃度80.0 mg/mL）和1.25 mL PBS溶液，漩渦混勻后于110 ℃油浴中分別反應0、5、10、15、20、30、45、60 min，取0.5 mL反應液參考文獻[18]測定丙烯醛含量，研究該體系中丙烯醛的形成過程。

在耐高溫玻璃瓶中，依次加入2.5 mL卵白蛋白溶液（質量濃度8.0 mg/mL）、1.25 mL葡萄糖溶液（質量濃度80.0 mg/mL）和1.25 mL不同濃度（0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L）的MA、DA-1、楊梅素溶液，漩渦混勻后于110 ℃油浴中反應30 min，取0.5 mL反應液按上述方法測定丙烯醛含量，以PBS代替楊梅素及其加合物作為對照，按公式（2）計算對丙烯醛的抑制率。

1.3.3 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1對油脂中丙烯醛形成的影響

分別稱取5.0 g未添加抗氧化劑的菜籽油于Rancimat油脂氧化穩定性測定儀的反應池中，量取50.0 mL超純水于對應的測量池中，設置空氣流速為20 L/h，溫度為180 ℃，分別反應0、15、30、60、120、240 min，取0.5 mL測量池中樣液參考文獻[18]測定丙烯醛含量，研究菜籽油加熱過程中丙烯醛的形成過程。

分別稱取5.0 g未添加抗氧化劑的菜籽油于反應池中，再分別添加MA、DA-1、楊梅素溶液使其最終濃度分別為0.25、0.5、1.0 mmol/L，超聲10 min使其完全溶解。分別量取50.0 mL超純水于對應的測量池中，設置空氣流速為20 L/h，溫度為180 ℃，反應60 min后取0.5 mL測量池中樣液，按上述方法測定丙烯醛含量，以PBS代替楊梅素及其加合物作為對照，按公式（2）計算對丙烯醛的抑制率。

1.3.4 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1對蛋糕中丙烯醛形成的影響

1.3.4.1 蛋糕的制作工藝流程

參考張偉君等[27]重油蛋糕的制作方法，稱取黃油、細砂糖、全蛋液和低筋面粉各100 g、鹽1 g、復合膨松劑2 g，在蛋液中分別加入含量為0.2、0.4、1.2 μmol/g（相對于配方總質量）的MA、DA-1和楊梅素。黃油切小塊后室溫軟化，加入細砂糖打發至膨發狀態，蛋液分3 次加入，每次需迅速攪拌至完全融合，最后加入混合粉翻拌均勻形成面糊。將面糊轉入裱花袋中，擠入模具內（七分滿），170 ℃烘烤30 min。

1.3.4.2 蛋糕中丙烯醛抑制率的測定

稱取0.5 g粉碎的蛋糕樣品，加入5.0 mL蒸餾水，漩渦混合3 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液。加入5.0 mL體積分數50%的甲醇溶液，漩渦混合后超聲萃取20 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，將兩次獲得的上清液合并混勻，8 000 r/min離心15 min，取3.0 mL上清液參考文獻[18]測定丙烯醛含量，以PBS代替楊梅素及其加合物作為對照，按公式（2）計算對丙烯醛的抑制率。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3 次，采用Excel 2010、SPSS17.0軟件分析實驗數據，結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析模式分析，顯著性差異采用Duncan檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1的抗氧化活性

2.1.1 總還原能力

圖2 MA、DA-1和楊梅素的總還原能力Fig.2 Concentration dependent reducing power of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin

由圖2可知，楊梅素與丙烯醛的加合物依然具有較強的還原能力，在濃度為0.01～0.1 mmol/L時，MA和DA-1的還原能力與VC之間沒有顯著性差異（P＞0.05），略低于楊梅素。當濃度增加至0.5 mmol/L時，楊梅素的還原能力顯著增強（P＜0.05），MA、DA-1的還原能力略低于VC。由此可知，楊梅素與丙烯醛加合物依然具有一定的還原能力。

2.1.2 DPPH自由基清除率

圖3 MA、DA-1和楊梅素的DPPH自由基清除率Fig.3 Scavenging effects of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin on DPPH free radicals

由圖3可知，隨著濃度的增加，楊梅素與丙烯醛加合物對DPPH自由基的清除率逐漸升高。MA（0.01～0.1 mmol/L）和DA-1（0.01～0.05 mmol/L）對DPPH自由基的清除率均強于VC，清除率均可達到60%以上，表明楊梅素捕獲丙烯醛后依然具有較強的DPPH自由基清除活性，MA和DA-1結構上保留的羥基可以提供質子，還原具有氧化性的自由基。在0.01～0.5 mmol/L濃度范圍內，楊梅素及其加合物對DPPH自由基的清除率存在顯著性差異（P＜0.05），但MA和DA-1依然顯示出較強的DPPH自由基清除能力。

2.1.3 油脂抗氧化能力

圖4 MA、DA-1和楊梅素對菜籽油氧化誘導時間的影響Fig.4 Effect of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin on the oxidation induction time of rapeseed oil

表1 菜籽油添加楊梅素和丙烯醛加合物氧化誘導時間的變化Table 1 Changes in oxidation induction time of rapeseed oil added with different antioxidants

本實驗采用Rancimat法，加速油樣氧化，將氧化產生的醛、酮、酸等物質導入蒸餾水中，測定蒸餾水的電導率突變點為誘導時間。誘導時間越長，證明油樣的抗氧化穩定性越強。從圖4和表1中可以看出，空白對照組的菜籽油氧化誘導時間為11.41 min，MA和DA-1在高溫下可將菜籽油的氧化誘導時間延長至約1.3～1.4 倍，與楊梅素將氧化誘導時間延長至約1.5 倍的效果相近，均可一定程度上提高菜籽油的氧化穩定性，減緩菜籽油的氧化酸敗。推測可能是由于這3 種化合物中的酚羥基均可提供氫質子與自由基結合，破壞了脂肪酸氧化的鏈式反應，同時通過螯合油樣中的金屬離子也有助于發揮抗氧化作用[28]。

2.2 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1對丙烯醛活性的影響

2.2.1 楊梅素加合物捕獲丙烯醛的能力

如圖5所示，當濃度在0.05～0.25 mmol/L時，DA-1、MA和楊梅素3 種化合物對丙烯醛的抑制率存在顯著性差異（P＜0.05），MA對丙烯醛的抑制率是DA-1的2 倍左右。當濃度增大至0.5 mmol/L時，DA-1對丙烯醛的抑制率大幅度增強，達60.7%，MA與楊梅素較為接近，高達80.5%。MA和DA-1對丙烯醛的高清除活性說明兩種加合物仍有繼續捕獲丙烯醛的能力。

圖5 MA、DA-1和楊梅素對丙烯醛的抑制率Fig.5 ACR inhibitory rates of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin

2.2.2 楊梅素加合物對卵白蛋白-葡萄糖體系中丙烯醛形成的影響

圖6 反應時間對卵白蛋白-葡萄糖體系中丙烯醛含量的影響（A）及MA、DA-1和楊梅素對體系中丙烯醛的抑制率（B）Fig.6 Effect of reaction time on the production of ACR in ovalbuminglucose system (A) and ACR inhibitory rates of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin (B)

雞蛋含有豐富的營養物質，氨基酸比例適合人體生理需要，易吸收，是重要的食品原料之一。本實驗通過構建卵白蛋白-葡萄糖模型，考察體系中丙烯醛形成過程的濃度變化。從圖6A中可以看出，隨著反應時間的延長，體系中丙烯醛的含量逐漸增加，在反應初期（5～10 min）反應速率最大，體系中丙烯醛含量迅速上升，在30 min時產生大量丙烯醛（149.9 μg/g），隨后體系中丙烯醛的含量維持在一定范圍內，因此選擇30 min（平臺期）作為后續實驗的反應時間。由圖6B可知，楊梅素及丙烯醛加合物可降低該體系中丙烯醛的含量，且隨著濃度的增加，抑制率顯著提高（P＜0.05）。當濃度為1.0 mmol/L時，DA-1和MA的抑制率分別為26%和34%，楊梅素的抑制活性較高，可以清除48%的丙烯醛，接近半抑制率。

2.3 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1對菜籽油中丙烯醛形成的影響

大量研究顯示，油脂在熱加工過程中發生氧化反應是食源性丙烯醛的主要來源之一[29]。菜籽油相較于其他種類的油脂其亞麻酸含量較高，使得在熱加工過程中產生較多的丙烯醛[30]。本實驗選擇菜籽油為考察對象，由圖7A可知，0～60 min內，由于體系中亞麻酸含量高，丙烯醛生成量迅速增加，隨著反應的進行亞麻酸被破壞分解，在60～120 min內丙烯醛含量增長緩慢至最大值（87.4 μg/g）。繼續加熱（120～240 min），體系中丙烯醛的含量呈下降趨勢，其原因可能為：1）丙烯醛熱穩定性較差，在高溫下會分解成丙二醛等化合物[30]；2）在較高的溫度下，隨著反應時間的延長菜籽油中的三酰甘油會形成三酰甘油聚合物，而不是氧化產生丙烯醛[31]。鑒于加熱60 min時丙烯醛含量接近最大值，后續實驗選擇60 min作為反應時間。由圖7B可知，DA-1、MA和楊梅素對菜籽油熱加工過程中產生的丙烯醛均有一定的抑制效果，且隨著濃度的增加呈明顯上升趨勢。當濃度為0.25 mmol/L時，DA-1和MA對體系中產生的丙烯醛抑制效果較弱，抑制率不到20%；當濃度升高至1.0 mmol/L時，DA-1可清除體系中34%以上的丙烯醛，MA抑制率為43.4%。以上結果表明，楊梅素與丙烯醛的加合物在油脂加熱過程中仍可發揮清除丙烯醛的功效，推測其作用機制可能是化合物捕獲丙烯醛與抗氧化活性的共同作用。

圖7 加熱時間對菜籽油中丙烯醛含量的影響（A）及MA、DA-1和楊梅素對體系中丙烯醛的抑制活性（B）Fig.7 Effect of heating time on the production of ACR in rapeseed oil (A) and ACR inhibitory rate of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin (B)

2.4 楊梅素與丙烯醛加合物MA、DA-1對蛋糕加工中丙烯醛的抑制率

圖8 MA、DA-1和楊梅素對重油蛋糕中丙烯醛的抑制活性Fig.8 ACR inhibitory rate of MA and DA-1 myricetin adducts and myricetin in pound cakes

重油蛋糕中添加的黃油脂肪含量較高，脂質在烘焙過程中發生氧化反應從而生成丙烯醛，此外，原料中含有較高含量的蛋白質和碳水化合物，其所發生的美拉德反應和碳水化合物裂解也是蛋糕中丙烯醛的主要來源。由圖8可知，楊梅素與丙烯醛加合物對蛋糕烘焙過程中產生的丙烯醛有一定的抑制活性，當添加量從0.2 μmol/g增加至1.2 μmol/g時，DA-1對體系中丙烯醛的抑制率從10.1%顯著提高至31.9%，MA從15.8%顯著提高至41.4%（P＜0.05）。相同添加量時，抑制率從小到大依次為DA-1＜MA＜楊梅素。推測在蛋糕烘焙過程中一方面MA和DA-1仍具有捕獲丙烯醛的活性位點，對于已產生的丙烯醛可將其捕獲；另一方面，加合物發揮后續抗氧化作用，減緩了脂質的氧化速率[32]，抑制了丙烯醛的產生，從而有效降低蛋糕中丙烯醛的含量。

3 結 論

楊梅素與丙烯醛加合物依然具有抗氧化清除自由基的活性，且抗氧化能力隨著濃度的增大而增強，在濃度0.01～0.1 mmol/L范圍內，MA和DA-1的總還原能力及對DPPH自由基的清除率接近甚至高于VC，并且可以將菜籽油的氧化誘導時間延長至1.3～1.4 倍，與楊梅素效果相近，能夠減緩氧化酸敗速率，具有較高的體外抗氧化活性。MA和DA-1結構中的活性位點使得其可通過直接捕獲降低體系中丙烯醛的含量，抑制活性較高，最高抑制率分別為80.5%和60.7%，并可有效抑制卵白蛋白-葡萄糖模型中丙烯醛的產生。在進一步建立的菜籽油熱處理體系中，濃度為1.0 mmol/L的MA、DA-1和楊梅素可分別抑制43.4%、34.5%和57.6%的丙烯醛；在蛋糕體系中，添加量為1.2 μmol/g的MA和DA-1可分別抑制41.4%和31.9%的丙烯醛，而楊梅素抑制率為57.6%，推測一方面加合物可以直接捕獲體系中已產生的丙烯醛；另一方面加合物的抗氧化活性可以減緩體系中脂質在高溫下的氧化速率，從而減少丙烯醛的產生。可見楊梅素在捕獲有害物質丙烯醛后，形成的加合物依然具有較強的后續抗氧化性和抑制丙烯醛的能力，體現了楊梅素反應的持續活性和長效性，從而有利于保證食品在加工和貯藏過程中的安全性。

鑒于以上楊梅素及其加合物的優良功能活性，下一步將對其毒理性和安全性做深入系統的研究。