[C4mim]BF4、[C4Py]Cl離子液體與木瓜蛋白酶相互作用的熒光光譜分析和分子對接

田康永，楊呂清，胡慧慧，張海德*

（海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228）

木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）存在于番木瓜乳膠中，是由212 個氨基酸殘基組成的含巰基的肽鏈內切酶。木瓜蛋白酶的肽鏈之間形成3 個二硫鍵，肽鏈折疊成兩個結構域，一個結構域主要由α-螺旋結構在空間內卷曲折疊而成，另一個則由β-折疊和部分α-螺旋構成。木瓜蛋白酶的活性中心位于兩個結構域間的第25位半胱氨酸殘基和第158位組氨酸殘基所在的凹槽內[1]，分子質量為21 kDa，具有凝結牛奶、水解脂肪、溶解細菌，以及其他作用[2]。因此，木瓜蛋白酶可用于許多領域，例如食品、醫藥、皮革、飼料、化妝品、紡織和制藥工業[3-5]。離子液體作為非常規溶劑已廣泛用于各種液相萃取模式中，因其固有的離子特性和顯著的性質（例如可忽略不計的蒸氣壓、無效可燃性、高離子傳導性、以及高熱和電化學穩定性），所以成為“綠色溶劑”的重要一類[6-7]。

雙水相體系指一些具有親水性質的高分子聚合物與聚合物，或聚合物與無機鹽溶解在水中，當濃度超過一定界限時，能自然地分成互不相溶的兩相或多相體系，其原理主要是聚合物的不相容性，雙水相體系主要是在水環境中產生的[8]。離子液體雙水相基于離子液體的各種優點，將離子液體應用到體系的某一水相中，運用離子液體與無機鹽競爭水分子使目標物質有選擇性地富集在離子液體相或鹽相[9]。離子液體雙水相溶液酸度范圍較寬、不易乳化、界面更清晰、黏度小、不需要揮發性有機溶劑、生物相容性好、離子液體經簡單處理可重復再利用[10]，因此該技術在木瓜蛋白酶的制備中占有一席之地。

本課題組長期致力于離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的研究。曾穎等[11]運用1-辛基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[C8mim]Ac）與磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相體系萃取木瓜蛋白酶，得到酶分配系數高達11.52，酶活力回收率為86.81%。蔡濤等[12]運用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4mim]BF4）與磷酸氫鈉（NaH2PO4）雙水相萃取木瓜蛋白酶，得到酶分配系數為4.77，酶活力回收率達97.45%。Zhu Xinyun等[13]運用1-丁基氯化吡啶（[C4Py]Cl）與磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相萃取木瓜蛋白酶，酶活力回收率達96.03%，分配系數為4.57。離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶取得了較好的成果，但相關的理論研究較少，本研究利用熒光光譜與分子對接分析[C4mim]BF4、[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶之間的相互作用，以期為離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（均為生物純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；K2HPO4（分析純）西隴科學（廣東）股份有限公司；[C4Py]Cl、[C4mim]BF4（均為分析純） 美國ALFA試劑公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

TU1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-7000分子熒光光譜儀 日本日立公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；FA2104電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光光譜法分析相互作用

根據Li Xiangrong[14]和Xiao Huizhi[15]等探究分子間相互作用的方法，于一系列10 mL比色管中添加1 mL 6×10-5mol/L的木瓜蛋白酶儲備液，分別加入0.08、0.4、0.8、1.6、2、4 mL 5×10-4mol/L [C4Py]Cl和[C4mim]BF4儲備液，用水定容至10 mL，分別在25、30、35 ℃下恒溫水浴10 min后放入1.0 cm石英池中。

發射熒光光譜條件：激發波長280 nm、掃描波長范圍280～450 nm、激發和發射狹縫寬度2.5 nm。

1.3.2 熒光猝滅計算

采用Stern-Volmer方程（公式（1））計算猝滅常數（Kq），判斷熒光猝滅類型；使用雙對數方程（公式（2））計算相互作用過程的結合常數（Ka）和結合位點數（n）；使用Van’t Hoff方程（公式（3））計算反應的焓變（ΔH）和熵變（ΔS）；使用吉布斯自由能方程（公式（4））計算各溫度下反應的吉布斯自由能（ΔG）[16]。

式中：F0為無猝滅劑時反應體系的熒光強度/au；F為有猝滅劑時反應體系的熒光強度/au；τ0為無猝滅劑時熒光分子壽命/s：Kq為猝滅常數/（mol·s）；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/L）。n為結合位點數；Ka為反應的結合常數/（L/mol）；ΔH為反應的焓變/（kJ/mol）；ΔS為反應的熵變/（J/（mol·K））；R為氣體摩爾常數（8.314 J/（mol·K））；ΔG為反應的吉布斯自由能/（kJ/mol）；T為熱力學溫度/K。

1.3.3 分子對接探究對接結構

運用AutoDock軟件研究離子液體與木瓜蛋白酶的結合模式。離子液體的mol文件預先下載自Chemical Book數據庫（www.chemicalbook.com，CAS號為1124-64-7，174501-65-6）用Discovery Studio 軟件轉變為PDB格式，并只保留陽離子部分。木瓜蛋白酶的晶體結構下載自RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/，PDB編號1PPD），刪除水分子和非必需子結構，通過末端處理、加氫、加電荷等步驟完成受體結構的準備，采用半柔性對接法，其余參數默認。對接后，選取打分函數最高的結果作為研究對象[17]。

1.3.4 相同條件下不同離子液體雙水相體系分配系數的測定

構建[C4mim]BF4-K2HPO4、[C4Py]Cl-K2HPO4雙水相體系：固定K2HPO4添加量為0.35 g/mL、酶添加量為2.17 mg/mL、溫度30 ℃，離子液體質量濃度分別為0.20、0.24、0.28、0.32、0.36 g/mL，用水定容至10 mL。振蕩混勻后以5 000 r/min離心10 min，讀取上下相的體積，測定上下相的蛋白酶質量濃度，分配系數（K）的計算公式如（5）所示。

式中：ρT和ρB分別為雙水相體系中上、下相的蛋白酶的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 木瓜蛋白酶蛋白質量濃度的測定

用Bradford法來測定蛋白質的質量濃度[18]。以牛血清白蛋白為標準品配制系列質量濃度的標準溶液1.0 mL，取考馬斯亮藍G-250染色液5.0 mL，反應10 min左右，在595 nm波長處測定吸光度。以蛋白質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程為y＝0.013 6＋0.004 5x，R2＝0.998 1。

1.4 數據處理與分析

對每個添加不同體積離子液體溶液的樣本測定3 次，使用SPSS軟件的Duncan’s法對結果的方差顯著性進行分析[19]，采用不同小寫英文字母表示不同數據之間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析結果

熒光光譜法是在接近實際萃取環境下研究活性小分子與酶間相互作用應用最廣泛的方法，其基于小分子引起的酶蛋白內源熒光光譜變化來獲得二者的結合常數、結合位點數及熱力學參數等信息[20-21]。由圖1可知，隨著離子液體溶液添加量的增加，木瓜蛋白酶的熒光強度呈規律性降低，表明二者發生了相互作用。采用Stern-Volmer方程（公式（1））分析不同溫度下的熒光光譜最大吸收波長（表1），獲得相應的猝滅常數（表2）。不同溫度下的猝滅常數（Kq）均大于生物大分子動態熒光猝滅的最大常數2×1010L/（mol·s），表明離子液體通過與木瓜蛋白酶結合成復合物，引發了酶蛋白的靜態熒光猝滅[22]。

圖1 離子液體在不同溫度下對木瓜蛋白酶熒光光譜的影響Fig.1 Effect of ionic liquids on the fluorescence spectra of papain at different temperatures

表1 離子液體在不同溫度下木瓜蛋白酶熒光光譜最大吸收波長處熒光強度Table 1 Fluorescence intensity at maximum absorption wavelength of papain fluorescence spectrum of ionic liquid at different temperatures

表2 離子液體與木瓜蛋白酶間的熒光猝滅常數Table 2 Fluorescence quenching constants between ionic liquids and papain

對于靜態熒光猝滅過程，可以使用雙對數方程（公式（2））計算離子液體與木瓜蛋白酶相互作用過程的結合常數（Ka）和結合位點數（n），相關結果見表3。

表3 離子液體與木瓜蛋白酶間的結合參數Table 3 Binding parameters between ionic liquids and papain

由表3可知，隨著溫度的升高，離子液體與木瓜蛋白酶的結合常數明顯上升，而其結合位點數則略有增加，都趨近于1附近，因為兩種離子液體的猝滅常數并未遠大于動態猝滅常數，所以推測猝滅過程含有部分動態猝滅的特性，適當升溫不僅可以加速二者在溶液中的運動速率，提高結合效果，還可令木瓜蛋白酶結構更加伸展，暴露更多的結合位點[19]。為了理解離子液體與木瓜蛋白酶的結合過程，利用van’t Hoff方程（公式（3））和吉布斯自由能方程（公式（4））獲得了二者互作的熱力學參數（表4）。

表4 離子液體與木瓜蛋白酶間的熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters for interaction between ionic liquids and papain

離子液體與木瓜蛋白酶相互作用的ΔG為負值，表明離子液體與木瓜蛋白酶的結合是一個自發的過程，而ΔH和ΔS為正值，根據Ross等總結的藥物小分子與蛋白質大分子之間結合反應的熱力學參數數值正負性與作用力類型的關系[23]，二者的結合過程是一個以熵驅動為主的自發進行的過程，受疏水作用力驅動，這可能由于[C4mim]BF4和[C4Py]Cl在結構上具有一個疏水性的五元環和六元環[24]，因而在與酶的疏水口袋結合過程中，疏水力發揮了主要作用。

2.2 木瓜蛋白酶與離子液體的分子對接分析結果

離子液體與酶的互作涉及復雜的結構改變，目前多種實驗手段可用于此類研究，如光譜法（包括紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜、圓二色光譜等）、平衡透析、電泳及色譜等方法，還有新出現的等溫滴定量熱、核磁共振、表面等離子共振等方法[25]。但上述方法復雜的條件參數給研究帶來了極大困難，近年來，分子模擬方法成為互作研究的重要工具。分子對接已被用于研究多種小分子與酶蛋白的結合機制[26]。由于離子液體本身極化程度非常高，能被很清晰地分成陽離子部分和陰離子部分，因此無法在AutoDock軟件中將其設置為單一小分子進行對接[27]。考慮到離子液體與蛋白酶結合主要為陽離子在蛋白質表面聚集來影響蛋白酶的結構與活性的[28]，所以在對接過程中使用離子液體的陽離子部分進行對接研究。

表5 離子液體與木瓜蛋白酶分子對接的對接參數Table 5 Molecular docking parameters for interaction between ionic liquid and papain

圖2 離子液體與木瓜蛋白酶分子對接結果Fig.2 Molecular docking results of ionic liquid and papain

離子液體與木瓜蛋白酶的分子對接，選取結合能最低的對接構像為最優構像，從軟件AutoDock Tools中獲取離子液體與酶作用的模擬對接參數（表5）。由表5可知，離子液體的陽離子與木瓜蛋白酶的結合ΔG均小于0，且[C4Py]Cl的ΔG小于[C4mim]BF4，由此說明離子液體小分子與木瓜蛋白酶的結合是自發進行的，[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結合優于[C4mim]BF4。通過軟件分析可知，離子液體與木瓜蛋白酶的結合結構如圖2所示，只存在一個結合位點，其位于木瓜蛋白酶結構域中間活性部位的凹槽內，通過對木瓜蛋白酶表面作疏水性分析，離子液體完全處于木瓜蛋白酶的疏水性凹槽內，由此可以得出離子液體與木瓜蛋白酶之間存在較強的疏水相互作用，同時通過軟件分析發現還存在范德華力和π-π相互作用。分子對接的結果與熒光光譜的結果相一致，同時也證明熒光光譜結果的正確性。

2.3 相同條件下不同離子液體雙水相體系分配系數的測定分析結果

圖3 不同離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶的分配系數Fig.3 Partition coefficients of papain in aqueous two-phase extraction systems with different ionic liquids

為了驗證熒光光譜與分子對接結果在實際提取中的正確性，分別用兩種離子液體構建雙水相萃取體系，兩個體系均在相同的條件下進行且構成體系的其他成分均相同，離子液體相均在雙水相的上相，所以離子液體與木瓜蛋白酶的相互作用強度不同是木瓜蛋白酶分配系數不同的主要因素。如圖3所示，所有的分配系數均為正值，表明木瓜蛋白酶主要富集于離子液體相，隨著離子液體濃度的增加，兩個體系的分配系數K均呈現先增大后減小的趨勢，原因是適當加大離子液體質量濃度可以使相比例增大，因此K增大；繼續增大離子液體質量濃度，使得體系黏度增加，阻止了兩相分子間的轉移，在兩相之間形成乳化層，使下相的酶滯留在兩相之間，酶的分配系數反而降低[29]。另一方面離子液體質量濃度過高使離子液體產生擁擠，對蛋白質的折疊和穩定性有很大影響，擁擠會使不穩定的蛋白構象更不穩定，并有助于形成致密結構使蛋白的活性降低甚至失活[28]，所以離子液體質量濃度過高時分配系數K反而會降低。但是在相同離子液體質量濃度下，[C4mim]BF4-K2HPO4體系的分配系數K均小于[C4Py]Cl-K2HPO4體系，從結果可以直接得出[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結合能力優于[C4mim]BF4，由此證明熒光光譜和分子對接的結果是可以預測離子液體實際的萃取效果。

3 結 論

本實驗通過熒光光譜法得到兩種離子液體的猝滅機制均為靜態熒光猝滅且都有輕微動態熒光猝滅的特性，與木瓜蛋白酶結合生成復合物，結合位點數為1，通過ΔG的計算得出[C4Py]Cl的ΔG低于[C4mim]BF4，說明[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結合能力優于[C4mim]BF4。分子對接分析結果表明，離子液體位于木瓜蛋白酶中間活性區域的疏水口袋中，只有1 個結合位點，并與周圍眾多的氨基酸殘基存在疏水作用、范德華力和π-π相互作用等非共價鍵力，從模擬的角度驗證了熒光光譜結果的正確性。離子液體雙水相體系分配系數測定結果表明，離子液體與木瓜蛋白酶結合力的強弱會影響離子液體雙水相實際萃取木瓜蛋白酶的效果，且與熒光猝滅所得的結果相同。本研究補充了[C4Py]Cl和[C4mim]BF4離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的理論依據，為構建新離子液體萃取體系提供了參考。