凝固溫度對填充豆腐凝膠特性及分子間作用力的影響

金 楊，劉麗莎,2，張小飛，張 清，白 潔，郭 宏，彭義交,*

（1.北京食品科學研究院，北京 100068；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

填充豆腐是以葡萄酸-δ-內酯（glucono-δ-lactone，GDL）為凝固劑的豆制品，以其質地細膩、口感軟嫩、食用方便等特點深受我國消費者喜愛。自20世紀80年代以來，我國填充豆腐的生產一直沿用從日本引入的低溫點腦、高溫凝固的工藝。該工藝利用GDL在低溫下緩慢釋放H＋的特點，將加熱的豆漿降溫至15～20 ℃，與GDL快速混合，隨后升溫至85 ℃，升溫過程溶液中H＋濃度逐漸升高，促使變性的大豆蛋白發生凝聚，形成凝膠[1]。該工藝實現了填充豆腐自動化連續生產，提高了豆腐的生產效率，并延長了保質期。但是，低溫點腦、高溫凝固的生產工藝需要兩次升溫、兩次降溫，工藝復雜，設備投資高，增加了生產和維修成本，也造成能源浪費。同時，降溫點腦過程增加了產品微生物污染的風險，并且還存在凝固劑過量、豆腐口味發酸的問題。因此，在保證產品品質前提下，簡化生產工藝、減少能耗、降低生產成本，成為豆制品加工行業亟待解決的問題。

目前，國內外關于填充豆腐凝固機理的研究很多。大豆蛋白主要由大豆球蛋白（glycinin，11S）和β-伴大豆球蛋白（β-con-glycinin，7S）組成，7S和11S的變性溫度分別為70 ℃左右和90 ℃左右[2]。Campbell等[3]研究表明，中性條件下加熱大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）形成大的聚合體被GDL酸化時，SPI可與天然存在的蛋白共沉形成更大的聚合體，凝膠網絡結構主要靠疏水作用和二硫鍵維持。李里特等[4]研究顯示，隨著加熱溫度（80～95 ℃）升高，豆腐凝膠強度增強，加熱溫度越高，大豆蛋白暴露的活性基團越多，在凝固劑作用下，凝固形成的網絡結構越完整，凝膠強度越強。凝固溫度是影響豆腐品質的關鍵因素。一方面，凝固溫度影響大豆蛋白變性程度，隨著溫度的升高，大豆蛋白變性加劇，更多的疏水基團暴露，有利于凝膠網絡的形成[5]；另一方面，凝固溫度影響GDL分解釋放H＋速率，降低體系pH值能中和大豆蛋白表面電負性，使大豆蛋白凝聚成為網狀結構[6]。Chang等[7]從流變學的角度對GDL制備黑豆豆腐凝膠形成過程進行了研究，結果顯示黑豆豆腐飽和儲能模量（G’sat）受凝固溫度、豆漿濃度及GDL濃度影響，G’sat隨豆漿濃度和GDL濃度增大而增大，凝固溫度為75 ℃時，G’sat最大。Liu Zhisheng等[8]采用兩步法加熱，即在75 ℃加熱5 min，再升溫至95 ℃加熱5 min，制備內酯豆腐，其凝膠彈性顯著增加，豆腐保水性增強。GDL在水中的分解速率與溫度正相關，溫度越高，分解速率越快，蛋白凝聚速率越快[9]。陶汝清等[10]研究了以GDL為凝固劑，熱處理對SPI結構和凝膠性的影響，結果顯示，隨著加熱溫度在70～95 ℃范圍內升高，SPI中的自由氨基濃度、自由巰基含量及表面疏水性增高，SPI凝膠強度先上升后下降，凝膠失水率呈下降趨勢。李倩如等[11]研究了酸化速率對內酯誘導的SPI凝膠結構的影響，結果表明，溫度與蛋白凝膠的酸化速率成正比，隨著酸化速率的增加，大豆分離蛋白凝膠強度和剛性不斷提高。

本團隊研發的熱漿高效混合灌裝裝備可實現高溫豆漿與點腦劑的瞬時均勻混合，改變了傳統填充豆腐點腦過程需兩次升溫兩次降溫的生產工藝，簡化了生產設備，降低了生產能耗。本研究針對填充豆腐現有生產過程能源消耗大的行業共性問題，對熱豆漿與GDL混合過程蛋白質形成凝膠機制進行研究，為創制熱漿節能點腦技術及裝備提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆為市售。

GDL 上海黃浦食品添加劑有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250 美國Amresco公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AR1000旋轉流變儀 英國TA公司；TA-XT質構儀英國Stable Micro System公司；HTX酶標儀 美國BioTek公司；RJDN-1型熱漿連續式點腦裝備 北京食品科學研究院。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 RJDN-1型熱漿點腦裝備制備填充豆腐凝膠

采用新型低耗水制漿工藝制豆漿[12]，生豆漿加熱煮沸，保持3 min，所得熟豆漿的可溶性固形物含量為10 °Brix。豆漿分別于30、40、50、60、70、80、85 ℃下通過RJDN-1型熱漿點腦裝備與3%（質量分數，下同）GDL溶液按體積比20∶1混合，并在相應溫度下保溫20 min，于4 ℃下冷藏過夜制得凝膠。

1.3.1.2 模擬生產過程制備填充豆腐凝膠

大豆浸泡后制漿，生豆漿加熱煮沸，保持3 min，所得熟豆漿可溶性固形物含量為10 °Brix。之后將豆漿冷卻到20 ℃，將其與3% GDL按體積比20∶1混合均勻，置于85 ℃下凝固20 min，后繼續保溫20 min，之后置于冷水槽中冷卻1 h，于4 ℃下冷藏過夜制得成品。

1.3.2 凝膠形成過程的流變學特性測定

對凝膠在恒溫（30、40、50、60、70、80、85 ℃）凝固過程和模擬生產升溫凝固過程的流變學特性進行測定，具體方法參考文獻[13]。

取1.3.1.1節制備的2.0 mL 10 °Brix熟豆漿，加入流變儀平行板（d＝40 mm、間隙1 mm），刮去多余樣品，加入礦物油密封樣品防止測試過程水分蒸發。對于恒溫凝固過程流變學測定，分別預熱至30、40、50、60、70、80、85 ℃（根據目前實際生產情況，填充豆腐凝固升溫至85 ℃，為了與實際生產情況保持一致，因此實驗最高溫度設定為85 ℃）；對于升溫凝固過程，將溫度以0.2 ℃/s從20 ℃升至85 ℃，并維持15 min。再取0.1 mL 3% GDL溶液，快速注入平行板間隙中，開始測定樣品彈性模量G′和黏性模量G″隨時間的變化。其他測試參數：頻率1 Hz；應力0.1%；掃描時間：1 200 s。

1.3.3 質構特性測定

質構特性測定參考文獻[14]。采用取樣器制備直徑1 cm、高2 cm的圓柱形樣品，采用質構儀通過TPA模式測定凝膠的質構特性。測定條件：測前、測中、測后速率均為5 mm/s，壓縮比例30%，間隔時間5 s，探頭P/26。根據TPA質構曲線計算硬度、彈性、內聚性和黏著性。

1.3.4 感官評價

感官評價共有色澤、口感、外觀、風味4 項指標，每項滿分25 分，最低分0 分，分數越高表明該項品質越好。感官評價小組由10 名成員組成，6 名女性，4 名男性，均沒有大豆過敏史且每周食用豆腐制品至少一次[15-16]。感官評價標準見表1。

表1 填充豆腐感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of tofu coagulated with glucono-δ-lactone

1.3.5 蛋白分子間作用力測定

蛋白質分子間作用力測定參照Tan[17]和鄧麗[18]等的方法，并加以改進。稱取0.6 g凍干豆腐樣品加5 mL 0.6 mol/L NaCl，進行分離提取（5 000 r/min勻漿2 min，4 ℃放置1 h，再10 000 r/min離心20 min，于1 000 目濾布過濾，下同），得到上清液S1。所得沉淀加入5 mL提取液A（含1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl）后進行分離提取操作，得到上清液S2。所得沉淀加入5 mL提取液B（含8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl），分離提取兩次，合并兩次提取上清液得到S3。沉淀加入5 mL提取液C（含0.5 mol/Lβ-巰基乙醇、8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl）后進行分離提取，得到上清液S4。將每次離心取得的上清液置于4 ℃下保存。將上述上清液采用考馬斯亮藍法測定蛋白質量濃度。離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵相對含量分別為上清液S1、S2、S3和S4中蛋白質量濃度與這4 種上清液中總蛋白質量濃度的比值。

1.4 數據統計與分析

實驗做3 組平行，釆用Excel軟件統計數據，利用SPSS 22軟件對數據進行Duncan’s多重比較顯著性分析和雙變量相關性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 填充豆腐凝膠形成過程中的流變學特性分析結果

對于黏彈體系，G’和G”分別表示凝膠的“類固”程度（彈性）和“類液”程度（黏性）[18]。體系的動態流變曲線可以描述體系在凝固過程中凝膠形成的變化過程，G’反映體系凝膠強度的大小，G”反應體系黏性的大小。通過比較G’和G”隨時間的變化，可以反映體系中凝膠形成速率，以及凝膠在不同時間的狀態[19]。

由圖1可知，凝固溫度對填充豆腐凝膠的G’和G”影響較大。當凝固溫度小于60 ℃時，凝膠體系的G’和G”較小，形成的凝膠強度很差。而當凝固溫度不低于60 ℃時，體系的G’和G”較大。凝固反應初期，溫度越高曲線斜率越大，表現為凝膠反應速率越大；曲線達到穩定增長所需時間越短，表現為凝膠反應時間越短，凝膠反應結束時形成的凝膠強度越大。填充豆腐凝膠的形成受兩方面因素影響：一方面，GDL溶于水后會分解成葡萄糖酸，并釋放H＋，中和大豆蛋白表面電荷，從而使大豆蛋白發生聚集，形成凝膠[19]。溫度越高，GDL分解速率越快，體系中H＋濃度越高，凝膠反應越迅速，G’和G”增長速率越快[20]；另一方面，加熱會促使大豆蛋白質分子鏈展開，內部的疏水基團暴露于體系表面，疏水基團之間的相互作用，促使大豆蛋白分子結合在一起，形成凝膠[21]。溫度越高，大豆蛋白變性加劇，暴露出的疏水基團越多，形成凝膠越迅速，凝膠強度越高[4,22]。另外，由于大豆蛋白中的主要組分7S和11S蛋白，其變性溫度分別為70 ℃左右和90 ℃左右[2]，當凝固溫度過低時，即使有凝固劑的參與，也無法形成具有一定凝膠強度的蛋白質凝膠。由上述分析可見，高溫凝固有利于形成具有一定凝膠強度的填充豆腐，溫度越高，凝膠強度越大。

圖1 不同凝固溫度下填充豆腐的動態黏彈特性曲線Fig.1 Dynamic viscoelastic properties of tofu coagulated at different temperatures

2.2 升溫凝固與高溫下恒溫凝固對凝膠形成速率的影響

為了反映不同凝固過程對凝膠形成速率的影響，實驗模擬了實際生產中連續升溫凝固過程，測定了連續升溫條件下體系G’和G”隨時間的變化曲線（圖2），并測定了凝固溫度為85 ℃時體系G’和G”隨時間的變化曲線（圖3）。

圖2 模擬生產過程G’和G”隨時間變化曲線Fig.2 Changes in G’ and G” during simulated coagulation process at rising temperatures

由圖2可知，模擬生產過程中，凝固溫度隨時間從20 ℃逐漸升高至85 ℃為升溫凝固過程。當溫度低于70 ℃時，體系中G’和G”呈波動變化趨勢，且趨勢平緩；當溫度不低于70 ℃時，體系中G’＞G”，且這兩者均急速上升。在豆腐凝膠形成過程中，當體系為液態時，G”＞G’，體系表現為液體性質；隨著加熱與凝固劑的加入，G’和G”同時升高，當凝膠形成時，G’＞G”，體系表現為固體性質[20]。因此，可以根據G’和G”隨時間的變化曲線的交點，判斷體系的凝膠時間。現有的填充豆腐生產工藝，為了使豆漿在凝固前與GDL充分混合，采用了低溫混合、高溫凝固的生產工藝，凝固過程較緩慢，當溫度增至70 ℃時，G’＞G”用時250 s左右，開始形成凝膠。

圖3 填充豆腐85 ℃恒溫凝固過程中G’和G”隨時間變化曲線Fig.3 Changes in G’ and G” of tofu during coagulation at a constant temperature of 85 ℃

圖3表示85 ℃熱豆漿直接混合GDL時體系G’和G”隨時間變化曲線，此過程為恒溫凝固。由于85 ℃下凝固反應迅速，為了清晰地反映體系凝固過程G’和G”的變化，圖3只截取了反應前幾秒體系G’和G”隨時間變化曲線。由圖3可知，85 ℃熱漿直接混合GDL時，凝固反應極快，僅用時1.8 s左右。對比圖2與圖3可知，與傳統的連續升溫凝固過程相比，85 ℃下凝固反應極為迅速。因此，要實現85 ℃下均勻凝固，需要在極短的時間內完成凝固劑與豆漿的快速混合。而現有的生產設備無法實現高溫下豆漿與GDL均勻快速混合，也就不能形成完整均勻的豆腐凝膠。基于改進現有工藝的難題，解決豆制品加工能耗高的瓶頸，本團隊采用撞擊流原理所研制的熱漿連續式點腦裝備實現了豆漿與GDL瞬間均勻混合，使內酯豆腐高溫點腦、灌裝、成型一系列過程同時完成[23]。

2.3 凝固溫度對填充豆腐凝膠強度的影響

圖4 不同凝固條件填充豆腐的G’最大值Fig.4 G’max of tofu under different coagulation conditions

圖4對比了不同凝固溫度下，填充豆腐彈性模量G’的最大值。凝固溫度從60 ℃升高至70 ℃時，顯著增加（P＜0.05），之后隨著凝固溫度升高，緩慢增加。溫度越高，大豆蛋白變性越充分，暴露出的疏水基團越多，酸化后形成的網絡越穩定，凝膠強度越大，凝膠的彈性模量越高[24]。當凝固溫度達到85 ℃時，為143.5 kPa。而模擬實際生產條件，得到的填充豆腐為129.7 kPa。雖然通過兩種凝固方式都能形成較穩固的凝膠結構，但采用85 ℃高溫快速凝固比采用連續升溫凝固更有利于增加填充豆腐凝膠強度，提高填充豆腐品質。

2.4 凝固溫度對填充豆腐質構特性的影響

表2 不同凝固溫度及模擬生產過程填充豆腐質構特性的比較Table 2 Comparison of texture properties of tofu prepared at different coagulation temperatures and under simulated production conditions

質構特性是豆腐品質評價的主要手段，硬度、內聚性、彈性、黏著性是豆腐質構評價的主要指標[25-26]。表2表明，隨著凝固溫度升高，填充豆腐的硬度、彈性、內聚性、黏著性不同程度地增加。當凝固溫度小于60 ℃時，凝膠彈性、硬度、黏著性都很低，凝膠成半凝固狀態；當凝固溫度大于70 ℃時，凝膠的硬度、內聚性和黏著性顯著提高（P＜0.05）。不同凝固溫度下凝膠的質構特性與對應的流變曲線變化規律一致。與模擬生產過程制得的填充豆腐相比，凝固溫度為85 ℃時，豆腐硬度、彈性、內聚性和膠黏性均顯著提高（P＜0.05）。由此可見，利用本實驗室研制的熱漿連續式點腦裝備制作的填充豆腐品質優良。

2.5 凝固溫度對感官評分的影響

圖5 不同凝固溫度及模擬生產條件下填充豆腐的感官評分Fig.5 Sensory scores of tofu prepared under different coagulation temperatures and simulated production conditions

根據流變特性分析可知，凝固溫度≥60 ℃時，可以形成具有一定凝膠強度的豆腐凝膠。因此，本實驗選擇了凝固溫度為60、70、80、85 ℃的填充豆腐并與模擬生產過程連續升溫條件下的填充豆腐進行感官評價，結果如圖5所示。不同凝固溫度形成的填充豆腐，在風味、口感、外觀方面有明顯差異，色澤差異較小。85 ℃下凝固的填充豆腐在色澤、風味、口感、外觀4 個指標中得分均最高，隨著凝固溫度降低，填充豆腐凝膠強度下降，產品的外觀、口感、風味也變差。與模擬生產條件的填充豆腐相比，凝固溫度為85 ℃時的填充豆腐豆香味更濃，且無酸味，豆腐彈性更強，豆腐更加完整，斷面光滑。

2.6 凝固溫度對填充豆腐分子間作用力的影響

圖6 不同凝固溫度下填充豆腐化學作用力的變化Fig.6 Change in chemical forces of tofu at different coagulation temperatures

豆腐凝膠特性的差異反映了大豆蛋白分子結構的不同[27]。對大豆蛋白空間構象影響最主要的分子間作用力為氫鍵、離子鍵、二硫鍵、疏水作用[28]。本研究對不同凝固溫度對填充豆腐凝膠作用力的影響進行了分析，探討了高凝固溫度下豆腐凝膠的成型機理，為熱漿連續式點腦裝備開發與應用提供理論依據。

由圖6可知，隨著凝固溫度的升高，凝膠體系中的離子鍵和氫鍵相對含量均顯著下降（P＜0.05）。當凝固溫度從50 ℃升高至60 ℃時，體系中離子鍵相對含量和氫鍵相對含量分別下降56.9%和51.5%。離子鍵和氫鍵是維持蛋白質分子構象的重要作用力[29]，它們主要存在于蛋白質分子的極性基團之間[30]。豆漿經煮漿加熱，維持蛋白質構象的氫鍵、離子鍵發生斷裂，蛋白質分子鏈展開，內部疏水基團及活性基團暴露[31]。低溫點腦時，由于溫度下降，變性的大豆蛋白會部分發生復性，疏水基團被重新掩藏[32]，帶電的極性基團重新結合，形成新的離子鍵、氫鍵以穩定蛋白質分子結構，因此低溫點腦時，體系的離子鍵和氫鍵含量較高。高溫點腦時，隨著體系pH值快速下降，蛋白分子的表面電荷被中和，極性基團靜電斥力下降[33]，分子間的疏水基團相互結合，促進蛋白凝膠的形成。因此，高溫點腦時體系的離子鍵和氫鍵含量下降。

隨著凝固溫度的升高，填充豆腐疏水相互作用和二硫鍵相對含量均呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。當凝固溫度從50 ℃升高至60 ℃時，體系中疏水相互作用相對含量和二硫鍵相對含量分別提高17.8%和11.2%。疏水相互作用是存在于大豆蛋白非極性基團之間的作用力[34]，而二硫鍵是兩個半胱氨酸殘基中的巰基氧化后形成的共價鍵，存在于蛋白質肽鏈的鏈內和鏈間[29]。二者均是蛋白凝膠形成過程中主要的作用力，對穩定蛋白質空間結構起到重要作用[35]。當凝固溫度較低時，大豆蛋白變性不充分，疏水基團、巰基等可以相互作用的基團仍被包裹在分子內部，蛋白分子間能夠相互作用的活性基團較少，無法形成疏水相互作用和二硫鍵。此時，無論添加何種凝固劑都難以形成豆腐凝膠，呈半流體狀[25]。在較高溫度下點腦時，蛋白分子內部的疏水基團和巰基暴露，蛋白質表面疏水作用力增強[36]，暴露的巰基使蛋白質之間產生交聯作用，形成牢固的二硫鍵[37]。隨著GDL水解釋放H＋，蛋白質分子間的靜電斥力下降，再加上疏水作用和二硫鍵的結合力，大豆蛋白凝膠形成[21,38]。

2.7 填充豆腐分子間作用力與質構特性相關性分析

分子間作用力是維持凝膠外觀形態及物性的主要作用力[18]。由表3可知，反映填充豆腐質構特性的指標與分子間作用力之間呈較強的相關性。其中，填充豆腐凝膠彈性和內聚性與離子鍵、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵的相對含量呈顯著相關（P＜0.05）；硬度和黏著性與離子鍵、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵相對含量呈極顯著相關（P＜0.01）。

表3 填充豆腐質構特性與分子間作用力之間的相關性Table 3 Correlation between texture characteristics and chemical forces of tofu

3 結 論

與傳統的連續升溫凝固方式相比，高溫凝固更有利于得到凝膠強度大的填充豆腐。當凝固溫度為85 ℃時，凝固反應用時1.8 s左右，最終形成凝膠的G’max為143.5 kPa，凝膠強度大于傳統工藝制備的填充豆腐。高溫凝固有利于提高填充豆腐的質構特性。凝固溫度大于70 ℃，凝膠的硬度、內聚性和黏著性顯著提高（P＜0.05）。感官評價結果表明，凝固溫度為85 ℃時，制得的填充豆腐色澤、風味、口感、外觀均優于模擬生產條件下的填充豆腐。

疏水相互作用、二硫鍵、氫鍵、離子鍵為填充豆腐凝膠的主要分子間作用力。隨著凝固溫度的升高，離子鍵和氫鍵所占比例顯著下降，疏水相互作用和二硫鍵所占比例升高。填充豆腐質構特性與分子間作用力之間具有高度相關性。當凝固溫度較低時（＜60 ℃），形成填充豆腐凝膠的主要分子間作用力為疏水相互作用和氫鍵，此時凝膠彈性、硬度、黏著性和內聚性均較低；當凝固溫度較高時，形成凝膠的主要化學作用力為二硫鍵和疏水相互作用。此時，凝膠強度較高，凝膠彈性、硬度、黏著性和內聚性均較高。

以上表明，利用本團隊研發的熱漿連續式點腦裝備，可以實現85 ℃豆漿與GDL瞬間混合，并同時完成灌裝凝固過程。該工藝制得的填充豆腐彈性、硬度俱佳，明顯優于市售同類產品。該結果為熱漿自動點腦裝備的開發及標準化加工提供了基礎數據及理論支持。下一步將在本研究的基礎上，從不同凝固過程形成凝膠的微觀結構、膠凝過程的分子作用機制等方面進行深入探討。