ε-聚賴氨酸對腐生葡萄球菌細胞結構與能量代謝的影響

藍蔚青，張楠楠，陳夢玲，謝 晶,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種具有抑菌功效的陽離子多肽，具有抑制效果好、抑菌性廣等優點[1]。研究表明，ε-PL的抑菌機制主要為作用于細胞膜和細胞壁導致細胞死亡，對細菌的呼吸作用有一定影響，同時還可能作用于酶或功能蛋白系統[2-4]。

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）是食品中的主要腐敗菌，為革蘭氏陽性菌，能在食品貯藏過程中分泌蛋白酶與脂肪酶，導致蛋白質降解與脂質氧化，影響其品質[5-6]。目前也有相關學者開展對腐生葡萄球菌的抑菌機理研究，如蘇萌萌等[7]研究發現綠原素能作用于腐生葡萄球菌細胞膜，使細胞膜嚴重受損，導致膜電位發生變化，胞內大分子物質泄漏而達到抑菌目的；朱亞珠等[8]通過實驗得出山梨酸鉀、雙乙酸鈉與異抗壞血酸鈉組成的復合保鮮劑能明顯降低腐生葡萄球菌的生長速率，使菌體破裂，核酸與蛋白質外泄，導致其死亡。但目前開展抗菌多肽對腐生葡萄球菌作用機制方面的研究較少。相關研究表明，抗菌肽抑菌劑破壞細菌細胞結構后，其進入菌體細胞內，可能會影響細胞代謝[9]。三羧酸循環是生物細胞中重要的代謝途徑，其不僅能提供能量，還是糖、脂肪與蛋白質轉化的樞紐。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）與蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）是三羧酸循環中重要的調控酶，會對三羧酸循環，甚至整個細胞代謝帶來影響[10]。本研究以ε-PL對腐生葡萄球菌細胞膜影響為出發點，由細菌生長曲線、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶、電導率、紫外吸收值與掃描電子顯微鏡觀察，研究ε-PL對腐生葡萄球菌細胞結構的影響，并通過檢測琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、過氧化物酶（peroxidase，POD）與過氧化氫酶（catalase，CAT）等呼吸代謝關鍵酶活性變化，進一步探究ε-PL對腐生葡萄球菌能量代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）為課題組前期從腐敗大黃魚中分離、篩選、鑒定并保存的菌株。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基 青島海博生物技術有限公司；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、AKP測試盒、超微量總ATP酶測試盒以及POD、CAT、SDH、MDH試劑盒 南京建成生物工程研究所；氯化鈉、無水乙醇、戊二醛、磷酸鹽、氯化碘硝基四唑紫（iodonitrotetrazolium chloride，INT）等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BCD-256KF冰箱 青島海爾股份有限公司；MLS-3750滅菌鍋 日本SANYO公司；ZQZY-70B振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；LDZM-40KCS-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；VS-1300L-U型超凈臺 蘇州蘇凈安泰集團；M334712全自動微生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；Centrifuge 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Synergy2自動酶標儀 美國BioTek公司；DDB-11A電導率儀 杭州奇威儀器有限公司；S3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi株式會社。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

挑取單菌落于10 mL TSB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養18 h，以1%（體積分數，后同）接種量接入10 mL的TSB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養18 h，4 ℃、3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，用0.85%生理鹽水調整菌液，菌液濃度為106～107CFU/mL，現配現用。

1.3.2 最小抑菌濃度測定

采用肉湯稀釋法測定ε-PL對腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），即7 ℃下培養24 h，明顯抑制微生物生長的最小濃度[11]。收集對數生長期的菌液，加入無菌TSB培養液稀釋至106CFU/mL。采用二倍稀釋法將ε-PL在無菌TSB中依次稀釋，使其終質量濃度分別為32、16、8、4、2、1 mg/mL，用無菌水代替ε-PL作為對照組。37 ℃下培養24 h。通過比較ε-PL處理前后的吸光度變化，得出其MIC為1.0 mg/mL。

1.3.3 細菌生長曲線的繪制

將已制備的菌懸液按1%接種量分別加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對照組（CK）。37 ℃、170 r/min搖床培養24 h，用全自動微生物生長曲線分析儀每隔1 h自動測定600 nm波長處的OD值。

1.3.4ε-PL處理后腐生葡萄球菌細胞壁、細胞膜通透性的測定

將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對照組。37 ℃、170 r/min搖床培養，每隔2 h取樣1次，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照AKP和超微量總ATP酶測試盒進行AKP和ATP酶活力測定，研究ε-PL對菌體細胞壁通透性的影響；測定上清液在260 nm波長處的OD值，研究ε-PL對細胞膜通透性的影響；用電導率儀測定上清液的電導率，研究ε-PL對細胞內容物泄漏的影響。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察菌體形態

將制備好的菌懸液按1%接種量分別加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃、170 r/min搖床培養12 h后，取2.0 mL菌液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集沉淀。用2.5%戊二醛溶液重懸，并在4 ℃固定10 h。用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體后，再用30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無水乙醇依次進行梯度脫水。冷凍干燥后，將其涂于金屬載體上，噴金，進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6ε-PL處理后腐生葡萄球菌POD和CAT活力的測定

參考廖石榴等[12]的方法，將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對照組。37 ℃、170 r/min搖床培養。取10 mL低溫下超聲2 min，4 ℃、5 000 r/min離心12 min。取上清液，用試劑盒測定POD和CAT活力。

1.3.7ε-PL處理后腐生葡萄球菌SDH和MDH活力的測定

參考廖石榴等[12]的方法，將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加處理液組為對照。37 ℃、170 r/min搖床培養。取2 mL菌液，3 000 r/min離心15 min。將沉淀物用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次。向菌體中加入等體積的2 g/L溶菌酶，于38 ℃下作用15 min，取出后冰浴；加入Tris-十二烷基硫酸鈉緩沖液后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液用試劑盒進行SDH和MDH活力測定。

1.3.8ε-PL處理后腐生葡萄球菌細胞代謝活力的測定

參考劉喚明等[13]的方法，將制好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃作用1 h后，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀物。用生理鹽水洗滌2 次并將菌液濃度調至108CFU/mL，加入INT，使其終濃度為1 mmol/L，37 ℃作用30 min后，測定OD630nm，判斷ε-PL對菌體細胞代謝活力的影響。

1.4 數據處理與分析

以SPSS 17.5軟件中的單因素方差分析及Duncan新復極差法進行數據的差異顯著性分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。最終實驗數據均為3 次平行實驗的平均值，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 ε-PL對腐生葡萄球菌生長曲線的影響

使用全自動微生物生長曲線測定儀測定腐生葡萄球菌在不同質量濃度ε-PL作用下的生長情況，結果如圖1所示。

圖1 ε-PL對腐生葡萄球菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of ε-PL on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由圖1可知，CK組的腐生葡萄球菌生長呈“S”型，2～13 h為對數期，該階段菌體數量增長迅速，13 h后進入穩定期。與CK組相比，MIC組與2 MIC組菌體在2～13 h時的生長速度減慢，在13 h進入穩定期，MIC組與2 MIC組菌體數量小于對照組。可見，經MIC和2 MICε-PL處理后，腐生葡萄球菌的生長受到明顯抑制。

2.2 ε-PL對腐生葡萄球菌AKP活力的影響

AKP大多存在于細胞壁與細胞膜間。當細胞結構受到破壞，AKP由胞內滲出。因此，可通過檢測AKP的活力來判斷其對菌體細胞壁的破壞情況[14]。

從圖2可知，在0～2 h時，3 組樣品的AKP活力增長較快。2 h后MIC組和2 MIC組的AKP活力要高于對照組。其中，2 MIC組AKP活力增長更明顯。表明ε-PL處理能使腐生葡萄球菌的細胞壁通透性發生改變，導致AKP活力增加。這是由于ε-PL富含陽離子，會取代細胞壁表面的Ca2＋、Mg2＋，與負電性的脂多糖結合，導致細胞壁結構發生改變，從而穿過細胞壁作用于細胞膜。這與韓晴[15]的研究結果一致。

圖2 ε-PL對腐生葡萄球菌菌體AKP活力的影響Fig.2 Effect of ε-PL on AKP activity of Staphylococcus saprophyticus

2.3 ε-PL對腐生葡萄球菌總ATP酶活力的影響

ATP酶是廣泛分布在細胞膜上的酶，其主要是通過利用ATP水解產生的能量對Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋等進行由低濃度至高濃度的運輸，保持膜內外離子濃度的平衡，維持正常的生命活動[16]。因此，可通過ATP酶活力變化分析其對菌體細胞能量代謝的影響[17]。

圖3 ε-PL對腐生葡萄球菌總ATP酶活力的影響Fig.3 Effect of ε-PL on ATPase activity of Staphylococcus saprophyticus

由圖3可知，CK組菌液的ATP酶活力變化不明顯，保持相對平穩。而經MIC與2 MIC的ε-PL處理后，其ATP酶活力活力隨處理時間延長而降低。可能由于ε-PL作用于菌體后，導致其細胞膜受損，造成胞內的ATP酶活力下降[18]。因此，ε-PL的抑菌作用可使其能量代謝受到抑制，影響細胞供能等。該結果與Lin Lin等[18]的研究結果一致。

2.4 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞膜通透性的影響

細胞膜被破壞后，導致膜內物質泄漏出來[19]。因此，可通過檢測菌液在260 nm波長處的光密度來分析其對細胞膜的破壞程度[20]。

由圖4可知，隨著作用時間的延長，MIC組與2 MIC組菌液的OD值增加，且在2 h內明顯增加，隨后緩慢增長，而CK組菌液的OD值始終保持低水平。可見，ε-PL對菌體的細胞膜有一定破壞作用，破壞強度與ε-PL質量濃度呈正相關。菌液中胞外核酸含量的增加趨勢與周祺等[21]的結果一致，表明ε-PL對菌體細胞膜有破壞作用。

圖4 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of ε-PL on cell membrane integrity of Staphylococcus saprophyticus

2.5 ε-PL對腐生葡萄球菌電導率的影響

當抑菌劑破壞細胞膜后，細菌內部電解質外泄至培養液中，使電導率增加。因此，可通過菌液電導率的變化來分析其細胞膜的通透性變化[22]。

圖5 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of ε-PL on cell membrane permeability of Staphylococcus saprophyticus

由圖5可知，隨著處理時間的延長，3 組菌液的電導率均隨之增加。其中，CK組菌液在2 h內的電導率增加較明顯，隨后緩慢增長，并維持在相對穩定狀態。MIC與2 MIC組菌液的電導率始終高于CK組，其與處理液濃度呈正相關。可能是ε-PL破壞細胞膜，導致菌體膜破裂，胞內大量物質泄漏，影響其正常代謝，最終導致菌體死亡[23]。

2.6 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞形態的影響

CK組與ε-PL處理組中的腐生葡萄球菌掃描電子顯微鏡觀察結果如圖6所示。

圖6 ε-PL對腐生葡萄球菌處理前后掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of Staphylococcus saprophyticus cells treated or not treated with ε-PL

由圖6可知，CK組菌體形態飽滿、完整未變形；經MICε-PL處理后的菌體扭曲變形、表面粗糙。而經2 MICε-PL處理后，菌體在扭曲變形的同時，部分細胞相互黏結，形態破壞較明顯。表明ε-PL能破壞菌體形態，改變其通透性，達到抑菌效果。這與Li Yingqiu等[24]研究結果一致。

2.7 ε-PL對腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影響

POD與CAT是細胞內重要的保護酶，能清除活性氧自由基，保證細胞膜結構完整性[25-26]。其酶活力的降低會造成菌體的膜系統受損，影響細胞的正常生長代謝[12]。

圖7 ε-PL對腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影響Fig.7 Effect of ε-PL against on POD and CAT activity of Staphylococcus saprophyticus

由圖7可知，菌體經MIC與2 MICε-PL處理后，其POD和CAT活力低于CK組。隨著ε-PL質量濃度的增加，POD和CAT活力相應下降。可見，ε-PL可通過降低腐生葡萄球菌的POD、CAT活力，減緩其呼吸代謝，從而抑制菌體生長。

2.8 ε-PL對腐生葡萄球菌SDH與MDH活力的影響

SDH與MDH是三羧酸循環過程中的關鍵代謝酶[27-28]。因此，通過檢測腐生葡萄球菌中SDH和MDH活力可反映菌體的能量代謝狀況[29]。

圖8 ε-PL對腐生葡萄球菌MDH和SDH活力的影響Fig.8 Effect of ε-PL on MDH and SDH activity of Staphylococcus saprophyticus

如圖8所示，與CK組相比，ε-PL處理組的SDH與MDH活力降低，且隨著ε-PL質量濃度的增加，SDH活力逐漸降低，MDH活力的變化趨勢與SDH相似。結果表明ε-PL會降低腐生葡萄球菌的SDH與MDH活力，且ε-PL質量濃度越高，酶活力越低。可能是ε-PL主要通過抑制SDH和MDH活性，使三羧酸循環受阻，影響菌體正常的能量代謝，導致其細胞生長受阻。此結果和Yang Shuzhen等[30]研究結果一致。

2.9 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞代謝活力的影響

細胞代謝還原活力基于INT原理進行測定。三羧酸循環過程中，活細胞在脫氫酶作用下生成活化氫離子，其將INT還原成甲臜，可根據甲臜生成速率推測細胞代謝活力[31]。ε-PL對腐生葡萄球菌代謝活力的影響結果見圖9。

圖9 ε-PL對腐生葡萄球菌細胞代謝活力的影響Fig.9 Effect of ε-PL on cell metabolism of Staphylococcus saprophyticus

由圖9可知，ε-PL處理組的OD值低于對照組，且2 MIC組的OD值低于MIC組，說明ε-PL能抑制腐生葡萄球菌的代謝活性。可能是ε-PL作用于腐生葡萄球菌，導致細胞結構改變，內容物泄漏，對其代謝活力產生影響。

2.10 綜合分析結果

細胞膜是細菌結構的重要組成部分，是各種抗菌劑作用的主要場所。當細胞膜被破壞時，核酸等大分子與Na＋、K＋離子等內容物發生泄漏，由此可判斷細胞膜完整性[19,22]。圖10模擬還原了ε-PL破壞腐生葡萄球菌的細胞結構以及導致其內容物泄漏的過程。

圖10 ε-PL對腐生葡萄球菌抑制模擬圖[25]Fig.10 Schematic representation of the possible inhibitory mechanism of ε-PL against Staphylococcus saprophyticus[25]

ε-PL可進入細胞內膜降低腐生葡萄球菌的AKP與ATP活性，抑制其生長。ATP酶是一種基礎代謝酶，能催化ATP生成ADP，為細胞提供能量。ATP酶活性降低可能導致ATP從菌體中溢出，抑制其呼吸代謝。POD與CAT是生物體內的重要保護酶，能清除體內氧化自由基[25-26]。而SDH和MDH是三羧酸循環過程中的重要酶體系。SDH能催化琥珀酸生成延胡索酸，同時能將FAD轉化為FADH2；MDH能催化蘋果酸生成草酰乙酸，同時能將NAD＋轉化為NADH，而FADH2和NADH是呼吸鏈上的電子供體[27]。ε-PL抑制了菌體中的SDH和MDH活力，表明ε-PL可能阻止腐生葡萄球菌的信息與能量轉移。兩種酶能為細胞提供輔助因子和能量，其活性降低可能會阻礙碳水化合物的合成與細胞生長，甚至導致其死亡。

以上分析表明，含有陽離子殘基的ε-PL通過靜電作用吸引到帶有負電荷的細菌表面，當ε-PL達到一定濃度時，細胞磷脂膜結構發生變化，滲透性增強，細胞膜上形成孔洞，然后ε-PL通過膜上孔洞進入細胞，破壞微生物的正常生理代謝，引起細胞的物質、能量以及信息傳遞中斷，并與細胞的內部物質發生作用，破壞細胞的核心，造成紫外吸收物的滲出，最終導致細胞死亡。

3 結 論

本實驗通過MIC、細菌生長曲線、電導率、紫外吸收變化、AKP與ATP酶活力測定，結合掃描電子顯微鏡觀察，分析ε-PL對腐生葡萄球菌的作用機制。結果表明，ε-PL對腐生葡萄球菌的MIC為1.0 mg/mL，其能使細菌生長速率減緩，細胞壁與細胞膜通透性和完整性受損，內容物外泄，最終使菌體死亡。同時，ε-PL對腐生葡萄球菌三羧酸循環過程中的琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶抑制作用明顯，直接影響細胞電子傳遞鏈與呼吸作用，抑制其代謝活力，導致菌體死亡。ε-PL進入細胞內，抑制細胞膜上的ATP酶活力，導致細胞內多種代謝途徑受阻，同時影響細胞膜的穩定性和多種酶的反應活性。后續研究可考慮在DNA分子水平或結合蛋白組學進一步探究ε-PL的抑菌機制。