金槍魚暗色肉酶解優勢肽鑒定及其體外抗氧化和血管緊張素轉換酶抑制活性分析

王 銳，張迪雅，李 曄*，蘇秀榕

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211）

金槍魚又稱鮪魚、吞拿魚，是對硬骨魚綱（Osteichthyes）、鱸形目（Pereiformes）、鯖科（Scombridae）魚類中具有胸甲的幾個屬魚類的總稱[1]，金槍魚肉質鮮美、蛋白含量高、脂肪和熱量低，并含有豐富的二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和多種必需氨基酸。研究表明，DHA和EPA具有改善記憶力、降低血脂和膽固醇等多種保健功效[2]。金槍魚在加工過程中會產生大量副產物，如暗色肉、魚皮等，其中含有豐富的蛋白質和生物活性物質，但副產物大多被加工成飼料魚粉，利用率較低且造成環境污染。金槍魚暗色肉整體呈紅褐色并分布在體側線附近[3]，粗蛋白作為其主要構成占魚體質量的21%～22%，粗脂肪含量經檢測約為普通肉的3 倍，富含多種不飽和脂肪酸，其中EPA和DHA含量占總脂的17%～20%，并且含有豐富的Ca、Fe、Zn等礦物質元素[4]。但由于暗色肉肉質粗糙、腥味濃郁、難以加工和儲存[5]，因而一直被制成罐裝寵物食品[6]或被低值化加工成生產飼料。因此對此類副產物進行深入的開發利用，生產高附加值的產品具有重要意義。

蛋白酶水解技術是常用的制備生物活性肽的方法。因其反應條件溫和，不易造成氨基酸變性，具有較高的回收率和高效的反應速率，對環境污染較小，較酸法與堿法提取更為安全，被廣泛用于功能性產品的開發[7]。孫婷婷等[8]對金槍魚胰臟進行酶解，所得多肽對患有db/db糖尿病小鼠的血清胰島素、糖化血紅蛋白、血脂水平等具有明顯改善作用。劉建華等[9]通過胰蛋白酶酶解金槍魚暗色肉，發現其酶解液氨基酸組成豐富，可用作食品的營養補充劑。胡旭陽等[10]以日本黃姑魚魚肉為原料，通過木瓜蛋白酶制備出具有生理活性的免疫活性肽。

本研究以金槍魚暗色肉為原料，通過胰蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶酶解制備富含活性多肽分子的酶解液，并利用基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF MS/MS）測定酶解液中多肽分子質量，分析優勢肽序列。進一步采用Discover Studio軟件通過分子對接技術對酶解優勢肽功能進行預測，并通過體外活性實驗對多肽分子的抗氧化和降血壓活性進行驗證。以期為金槍魚暗色肉高值利用提供理論參考和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的金槍魚暗色肉取自寧波今日食品有限公司，取回實驗室后，4 ℃冰箱暫存，備用。

胰蛋白酶（4×103U/g）、堿性蛋白酶（2×105U/g）廣西南寧龐博生物工程有限公司；總氨基酸檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycylglycine，FAPGG）、血管緊張素轉換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）、2-[4-(羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES） 美國Sigma-Aldrich公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）、卡托普利北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5800 MALDI-TOF MS/MS儀 美國AB SCIEX公司；數顯恒溫水浴鍋HH-8 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚暗色肉酶解工藝優化

參考Wang Xiaonan等[11]的方法并略作調整，新鮮暗色肉從冰箱中取出，蒸餾水洗凈，清除雜物后，按一定固液比加入蒸餾水于組織勻漿機中，攪碎制成勻漿，調節溫度和pH值，加酶置于搖床水解。使用水解度作為評判指標，初始提取條件為魚肉組織與蒸餾水固液比為1∶4、酶解溫度45 ℃、酶解時間3 h、按底物質量3%的加酶量加入對應蛋白酶，在此基礎上通過單因素試驗對酶質量比、固液比、加酶量、酶解溫度和酶解時間進行參數優化。

單因素水平：胰蛋白酶與堿性蛋白酶的質量比：1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1、2∶3、3∶2；固液比：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7；加酶量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%；酶解溫度：35、40、45、50、55、60、65 ℃；酶解時間：1、2、3、4、5、6、7 h。

進一步根據Box-Behnken原理設計，以水解度作為響應值，加酶量、酶解溫度和酶解時間作為自變量，設計三因素三水平的響應面分析試驗[9,12]。

水解度計算如公式（1）所示。

1.3.2 酶解多肽的制備

利用優化后的酶解條件對暗色肉進行酶解，酶解結束后，90 ℃、10 min滅酶。酶解液于8 000 r/min離心20 min，取上清液，凍存備用[13]。多肽固相合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.3 酶解多肽序列分析

酶解液高速離心，取上清液40 μL，加水稀釋40 倍，吸取1 μL于5800 MALDI-TOF MS/MS儀靶版上點樣，待干后，再加入1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸基質，待干后進樣。采用MALDI-TOF MS/MS對酶解液進行序列分析。分別通過一級和二級質譜先后確定多肽分子質量和氨基酸序列。收集分析得到的樣品質譜圖，通過MASCOT軟件與譜庫對照后，確認多肽的一級結構[14]。

1.3.4 酶解多肽分子的功能篩選和分子對接

1.3.4.1 功能篩選

以1.3.2節所取得蛋白酶酶解液中的主導多肽作為分子對接中的配體，通過Discover Studio 2018軟件中的Build and Edit Protein模塊，輸入多肽氨基酸序列以獲得初步預測的多肽3D結構，再通過Minimize Ligands模塊中的Full Minimization功能對其能量進行最優化，使獲得的多肽3D結構同時具有最低能量。進一步用Pharma DB數據庫進行反向找靶[15]，運行Pharmacophore模塊中的Ligand Profiler工具篩選可與配體相互作用的靶標蛋白，預測多肽功能。

1.3.4.2 分子對接

在PDB數據庫中檢索并下載篩選靶標蛋白的三維結構，利用Discover Studio 2018軟件的Prepare Protein模塊處理蛋白，對其進行去水、加氫和優化蛋白質結構。在Tools Explorer模塊中的Define Receptor功能將處理好的蛋白分子設定為受體，利用CDocker工具對配體和受體進行分子對接[16]。

1.3.5 酶解多肽的體外活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

取0.1 mL待測樣品與等體積0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液混合搖勻，常溫避光靜置30 min，于517 nm波長處測定其吸光度，記作A1；同時測定0.1 mL待測樣品和等體積甲醇混合液的吸光度，記作A2；將0.1 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入等體積蒸餾水所測得的吸光度，記作A3。以蒸餾水調零校準，選擇GSH作為陽性對照[17]。每組各設有3 個平行實驗，DPPH自由基清除率參照公式（2）計算。計算DPPH自由基清除率達50%時待測樣品濃度，稱為半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），表示清除50%自由基活性所需多肽分子的有效濃度。

1.3.5.2 ACE抑制率的測定

以FAPGG溶液作為底物用于測定ACE抑制活性。取10 μL的ACE（0.1 U/mL）與4 倍體積的待測樣品混勻后，再加入50 μL的1 mmol/L FAPGG溶液（由pH 8.3、80 mmol/L HEPES緩沖液配制）。在37 ℃下記錄30 min內340 nm波長處吸光度的變化量，記作A0。空白對照將樣品溶液替換為HEPES緩沖液，相同條件下記錄于340 nm波長處吸光度的變化量，記作A1。陽性對照選用卡托普利[18]。每組各設有3 個平行實驗，抑制率參照公式（3）計算。計算ACE抑制率達50%時樣品濃度IC50，表示抑制50% ACE活性所需的樣品濃度。

1.4 數據統計分析

通過SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并對最小顯著差異進行兩兩比較，P＜0.05表示差異顯著。同時使用GraphPad Prism 5.0軟件通過非線性回歸曲線擬合計算IC50。實驗結果均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1 優化雙酶水解條件的單因素試驗結果Fig.1 Effects of various variables on the degree of hydrolysis

利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對金槍魚暗色肉進行酶解，以水解度為指標，通過單因素試驗分別優化酶質量比、固液比、加酶量、酶解溫度和酶解時間。結果如圖1所示，水解度隨著固液比、加酶量、酶解溫度的增加以及酶解時間的延長總體呈現先上升后下降的趨勢，確定最佳酶解條件為：酶質量比1∶1、固液比1∶4、加酶量2%、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗優化基礎上，根據Box-Behnken設計確定暗色肉酶解條件：A酶解溫度（45、50 ℃和55 ℃）、B加酶量（1%、2%和3%）、C酶解時間（4、5 h和6 h），響應面試驗設計和結果見表1。利用Design Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得到雙酶酶解時各變量的回歸方程：Y＝59.05＋1.20A-0.30B＋0.11C-0.022AB-0.082AC＋0.085BC-4.83A2-0.85B2-1.91C2。

表1 金槍魚暗色肉雙酶酶解條件響應面試驗設計與結果Table 1 Box-Behnken design with experimental and predicted values for response surface analysis

表2 金槍魚暗色肉雙酶酶解條件響應面優化回歸方程分析結果Table 2 Analysis of variance of quadratic polynomial regression equation

由表2可知，金槍魚暗色肉雙酶水解的回歸模型極顯著（P＜0.01），且回歸方程的失擬項不顯著（P＞0.05），這表明酶解時間、酶解溫度、加酶量對金槍魚暗色肉水解的影響顯著程度較高，并能與水解度同時進行高水平的擬合。此外，該模型的決定系數（R2）為0.991 8，調整決定系數（R2Adj）為0.986 5，都接近于1.0，表明該回歸方程能對金槍魚暗色肉雙酶水解工藝結果進行很好的預測。由此可知，三因素水平設計合理、方法可靠、操作穩定，該模型可用作分析數據。如圖2所示，3 個因素與水解度呈拋物線關系，等高線呈橢圓狀，表明各因素對金槍魚暗色肉水解度的影響呈非簡單的線性關系。回歸模型各項的方差分析結果還表明二次項A2對雙酶水解度影響高度顯著，二次項C2對雙酶水解度影響顯著，其他因素則影響不顯著。

圖2 金槍魚暗色肉雙酶酶解條件優化的響應面三維圖Fig.2 Response surface plots for the effects of the cross-interaction among factors on the degree of hydrolysis

隨著各因素水平增加，在一定范圍內，水解度呈不同程度的增加，當達到最高值時則又會呈現下降趨勢。響應面中最大響應值和各因素的變化程度均符合上述回歸方程。綜合響應面數學分析，確定最佳酶解條件為：酶解溫度51 ℃、加酶量2%、酶解時間5 h，水解度理論預測值為59.15%。采用上述優化酶解條件測得實際金槍魚暗色肉水解度為61.01%。實驗值與理論預測值具有較好的擬合性，表明此次響應面優化參數方案可應用于實踐中。

2.3 金槍魚暗色肉酶解多肽序列的分析結果

采用MALDI-TOF MS/MS對酶解液進行多肽分子質量測定，圖3為一級質譜（MS）和二級質譜（MS/MS）處理的結果。MALDI-TOF MS/MS檢測出2 個相對較強的質譜峰，雙酶酶解多肽中母離子m/z401.087 5的信號強度最高，m/z420.089 8信號強度次之，其余母離子信號強度偏低。故而，選擇其作為母離子進行二級質譜分析，所得結果進行譜庫對比，得到2 個優勢肽，分別為EPR（Glu-Pro-Arg）和VSSK（Val-Ser-Lys）。

圖3 金槍魚暗色肉雙酶酶解多肽的質譜圖Fig.3 Mass spectra of peptides from tuna dark muscle hydrolysate

2.4 酶解多肽（VSSK和EPR）的分子對接結果

利用Pharma DB模塊進行反向找靶，VSSK和EPR這2 種優勢肽對21 種靶標蛋白具有潛在的相互作用，如Antigen peptide transporter 1、Beta-secretase 1、Protein SCAF8、Interleukin-2、Replicase polyprotein 1ab等。其中，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）與ACE為VSSK與EPR所共有的能夠發生交互作用的靶標蛋白，并進一步利用CDocker模塊對多肽與靶標蛋白進行分子對接。

2.4.1 VSSK、EPR多肽分子與Keap1的分子對接結果

CDocker分子對接主要根據配體與受體相互作用的能量（-CDocker interaction energy，-EC）和相互作用的氨基酸位點等信息來確定結合的程度。其中-Ec亦反映配體和受體之間親和力的強弱。Keap1與各多肽的分子對接結果見表3和圖4。由表3可知，VSSK（63.361 9 kJ/mol）顯示出比EPR（59.209 3 kJ/mol）同Keap1具有更高的親和力。由圖4A可知，VSSK參與同Keap1中的5 個氨基酸殘基相互作用，并與His129、Lys131、Lys150和Cys151共形成4 個氫鍵；圖4B表明EPR與Keap1中7 個氨基酸殘基相互作用，其中與Gln86和Cys151形成2 個氫鍵。

表3 多肽分子與Keap1蛋白的分子對接結果Table 3 Results of molecule docking between peptides and Keap1

圖4 多肽分子與Keap1蛋白的相互作用Fig.4 Schematic of interaction between peptides and Keap1

2.4.2 VSSK、EPR多肽分子與ACE的分子對接結果

酶解多肽與ACE的分子對接結果見表4和圖5。如表4所示，VSSK（75.173 4 kJ/mol）相較EPR（60.105 4 kJ/mol），與ACE的親和力更為緊密。如圖5A所示，可知配體小分子VSSK同ACE中的5 個氨基酸殘基相互作用，其中與Ala356、Asp358和Ser355形成3 個氫鍵；如圖5B所示，可知配體小分子EPR與ACE中的5 個氨基酸相互作用，分別與Asn66與Ala356共形成2 個氫鍵。由此可知，多肽VSSK和EPR通過與ACE蛋白相互作用形成氫鍵等作用方式，從而抑制ACE活性。此外，VSSK的對接能量-EC較EPR更大，表明其對ACE活性抑制發揮更強的作用，推測其具有更好的降壓活性。

表4 多肽分子與ACE蛋白的分子對接結果Table 4 Results of molecule docking between peptides and ACE

圖5 多肽分子與ACE蛋白的相互作用Fig.5 Schematic of interaction between peptides and ACE

2.5 酶解液與合成多肽的體外活性比較結果

2.5.1 DPPH自由基清除活性

金槍魚暗色肉酶解液對DPPH自由基的清除率見圖6。當質量濃度在0～0.5 mg/mL變化時，DPPH自由基清除率變化幅度最大。比較酶解液與合成多肽的抗氧化活性，隨著其質量濃度的增加，抗氧化活性也相對上升。陽性對照GSH的IC50為0.045 mg/mL，雙酶酶解液的IC50為0.204 mg/mL，合成多肽的抗氧化活性相近，IC50分別為VSSK 3.050 mg/mL、EPR 3.368 mg/mL。與酶解液相比，合成多肽抗氧化活性相對較弱，在達到相近的DPPH自由基清除率前提下，需要更高的底物濃度。

圖6 酶解液與合成多肽的DPPH自由基清除活性Fig.6 DPPH radical scavenging activities of hydrolysate of tuna dark muscle and synthesized peptides

2.5.2 ACE抑制活性

圖7 酶解液與合成多肽的ACE抑制活性Fig.7 ACE inhibitory activities of hydrolysis of tuna dark muscle and synthesized peptides

酶解液與合成多肽的ACE抑制活性見圖7。結果發現，陽性對照卡托普利的質量濃度從0增加到0.5 mg/mL時，抑制率迅速上升至80%。此后，隨著質量濃度增加，抑制率上升緩慢，其IC50為0.094 mg/mL。酶解液（IC50為2.321 mg/mL）與合成多肽的ACE抑制率曲線相似。當質量濃度從0升高到0.5 mg/mL時，抑制率上升至27.89%，之后隨質量濃度增加，抑制率緩慢提高；當質量濃度達到2.0 mg/mL時，合成多肽VSSK的抑制率達45.25%，酶解液抑制率次之，為41.84%；當質量濃度達到3.0 mg/mL時，酶解液抑制率達到最大（58.59%），合成多肽VSSK和EPR的抑制率分別為50.18%和43.51%。VSSK的IC50為2.914 mg/mL，而EPR的IC50為4.857 mg/mL。上述結果表明，酶解液的抗氧化活性和ACE抑制率均優于合成多肽。

3 討 論

暗色肉在金槍魚加工過程中，因腥味重、肉質粗糙往往被剔除，但其富含蛋白質和不飽和脂肪酸等多種營養物質，如谷物蛋白中易缺乏的賴氨酸、豐富的DHA和EPA等。為減少生產廢料，提高產品附加值水平，實現對暗色肉高值化開發，利用蛋白酶酶解法制備具有一定生理功效的活性肽是目前采用的有效途徑。Han Jiaojiao等[19]通過優化胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解金槍魚暗色肉條件，最終確定兩酶質量比控制在2∶1、固液比為1∶9、加酶量為3%、溫度為55 ℃，在該條件下酶解4 h，所得水解度為60.7%。張朋等[20]利用堿性蛋白酶酶解金槍魚碎肉蛋白制備降壓肽，以ACE抑制率為指標，確定最佳酶解條件為：pH 9.5、酶用量1.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h。近期研究表明，蛋白質水解多肽的生理活性取決于多肽的氨基酸序列和分子質量的大小[21]，分子質量在0.5～3 kDa范圍內的多肽往往具有更好的活性[22]。Samaranayaka等[23]研究發現小分子質量的多肽可更有效地抑制脂質過氧化。Chi Changfeng等[24]研究發現分子質量較小的多肽（389.41、546.63 Da和432.52 Da）具備更好的抗氧化活性。研究表明，ACE抑制活性同肽的序列和分子質量的大小關系密切，具有ACE抑制活性的肽分子質量大小多集中于1 500 Da以下[25]。這可能是由于分子質量小，人體更容易吸收，故表現出更好的活性。本實驗利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶進行雙酶解，優化后的酶解條件為：酶質量比1∶1、固液比1∶4、加酶量2%、溫度51 ℃和酶解時間5 h，最終獲得61.01%的水解度。對酶解液采用MALDI-TOF MS/MS進行測序發現，多肽分子質量多集中于1 kDa以下，譜庫對比后確定酶解液中主導多肽為EPR和VSSK，分子質量分別為401.087 5 Da和420.089 8 Da。

Discover Studio是一款分子模擬對接軟件，能夠通過分子對接的方法對作用機理進行分析，廣泛應用于小分子配體與生物大分子間相互作用的表征、同源建模、分子動力學模擬等領域[26]。Wu Qiongying等[27]對蠶蛹蛋白水解物進行分離純化，得到ACE抑制肽Ala-Ser-Leu，并通過Discover Studio軟件對其抑制活性的機理進行了分析。鄭春松等[28]以補腎壯筋湯的藥物成分為研究對象，通過Discover Studio軟件進行分子對接，從而尋找補腎壯筋湯有效成分的作用靶標。本實驗利用Discover Studio軟件對酶解液中的優勢肽進行反向找靶，通過分子對接的方法對作用機理進行分析，對優勢肽進行針對性的功能預測[29]。篩選出VSSK和EPR的潛在靶標蛋白Keap1和ACE。

在生理條件下，Keap1是一種能夠抑制Nrf2活性，主要存在于細胞質中的多區域阻遏蛋白[30]。通常Nrf2與其抑制劑Keap1相結合，以非活性狀態存在于細胞質中，一旦細胞受到活性氧刺激，Nrf2與Keap1則發生解耦聯，活化的Nrf2轉運進入細胞核，激活靶基因表達，調控II相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉運體的轉錄活性，從而發揮抗氧化損傷的作用[31]。ACE屬于鋅結合蛋白酶家族，在被鋅和氯化物活化后，可通過腎素血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統對血壓進行調節并發揮關鍵作用[32]。

已有研究表明多肽的氨基酸組成與抗氧化活性有關，如疏水性氨基酸Val、Phe、Met、Pro、Tyr等[33-35]。含疏水性氨基酸的多肽通過與氧結合或抑制脂質中氫離子釋放的方式，達到氧化抑制作用[36]。推測VSSK中含有的疏水氨基酸Val和EPR中含有的疏水氨基酸Val、Pro可能是賦予多肽抗氧化活性的重要原因。此外，氫鍵對分子間相互作用至關重要[37]，已有研究表明氫鍵作用是構成多肽和ACE相互作用的主要方式，通過肽分子與蛋白殘基相結合形成的氫鍵來促進肽誘導的ACE活性抑制[38]。Fu Yu等[39]研究發現NMAINPSK與ACE形成的氨基酸殘基中含有Ala356，且由氫鍵形成，從而預測酶解多肽與ACE結合后，可抑制ACE活性，起到降血壓的功效。分子對接結果顯示，VSSK與ACE形成3 個氫鍵，而EPR與ACE形成2 個氫鍵，同時根據對接能量-Ec分析結果可知多肽分子與Keap1或ACE的親和力皆為VSSK大于EPR，故推測VSSK可能發揮更好的抗氧化活性與降壓活性。

此外，本研究結果表明，無論是DPPH清除活性還是ACE抑制活性，酶解液均優于合成多肽，能以更低的底物濃度達到更佳的清除和抑制活性效果，當組合化合物的等效濃度低于單獨作用的化合物時，可認為組合間發揮了協同作用[40]。杜昕等[41]研究發現由牦牛血發酵液菌酶聯合制備所得的產物較抗氧化肽擁有更好的抗氧化活性，更多的有效基團通過協同作用成為電子供體用以清除自由基，從而保護脂質不被氧化。本研究所得酶解液為混合物，推測可能是因為含有多種抗氧化活性的多肽分子發揮了協同作用。

4 結 論

本實驗采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對金槍魚暗色肉進行雙酶酶解，以提取生物活性肽，利用響應面法優化得到最佳酶解條件為：酶質量比1∶1、固液比1∶4、酶解溫度51 ℃、加酶量2%、酶解時間5 h，在此條件下測得金槍魚暗色肉水解度為61.01%，較單酶酶解更高。通過MALDI-TOF MS/MS對酶解液進行氨基酸序列測定，得到EPR、VSSK這2 個優勢肽，利用Discover Studio軟件中Pharma DB模塊篩選出優勢肽的靶標蛋白Keap1和ACE。通過分子對接，預測其具有良好的抗氧化活性和降血壓能力。體外實驗表明，酶解液較合成多肽具有更好的抗氧化活性和ACE抑制活性，推測與其中活性多肽的協同作用有關。本實驗結果為金槍魚暗色肉商業化利用與開發提供了研究方向。