草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油聯(lián)合抑菌作用及機(jī)理

王雪燕，陳 瑛，張嘉敏，施永清*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

抗菌肽的化學(xué)本質(zhì)是多肽，具有非特異性抗細(xì)菌、真菌和病毒的作用[1]。不同于傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制，抗菌肽不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，且抗菌譜廣，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物和癌細(xì)胞均有作用[2]。它還具有穩(wěn)定性好、水溶性好、對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞幾乎無(wú)傷害、在體內(nèi)無(wú)殘留等特點(diǎn)[3]，是化學(xué)防腐劑、抗生素等防腐抗菌藥物很好的替代品[4-5]，抗菌肽乳酸鏈球菌素Nisin已成功作為天然食品防腐劑應(yīng)用于食品防腐保鮮領(lǐng)域中[6-9]。關(guān)于魚(yú)類(lèi)抗菌肽的相關(guān)報(bào)道很多，如Lin等[10]從石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）中得到的抗菌肽Epinecidin-1分別對(duì)副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α均顯示抑菌作用；Lauth等[11]研究表明源自條紋鱸（Morone saxatilis）皮膚和鰓的抗菌肽Moronecidin對(duì)所有的G＋細(xì)菌和大多數(shù)G-細(xì)菌均有抑制作用。本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)數(shù)年酶解魚(yú)鱗研究獲得魚(yú)鱗抗菌肽，其對(duì)G＋細(xì)菌和G-細(xì)菌都有不同程度的抑菌效果[12]。天然植物精油也具有廣譜抑菌活性，F(xiàn)riedman等[13]發(fā)現(xiàn)，肉桂醛、香芹酚、丁香酚和百里香酚這4 種物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli）O157:H7、鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等多種病原菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抑菌活性[14-15]。但是，添加精油會(huì)使食品感官品質(zhì)受到較大影響。將精油和抗菌肽復(fù)配使用，可以降低精油使用過(guò)多造成的感官影響[16]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗菌肽、精油的抑菌機(jī)制已有較多報(bào)道。抗菌肽通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性導(dǎo)致細(xì)胞裂解，或者通過(guò)與膜的相互作用形成瞬態(tài)孔隙，將抗菌肽運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)并作用于胞內(nèi)物質(zhì)[17]。香辛料植物精油成分對(duì)微生物細(xì)胞抗菌作用機(jī)理為：降解細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞質(zhì)膜，破壞膜蛋白，使胞內(nèi)成分滲出、胞質(zhì)凝結(jié)，以及損耗分子主動(dòng)運(yùn)輸力[18]。

目前關(guān)于草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽和肉桂精油復(fù)配抑菌研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽、肉桂精油為原料，采用棋盤(pán)稀釋法測(cè)定二者聯(lián)合抑菌效果。通過(guò)對(duì)受試菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞膜滲透性、胞外乳酸脫氫酶活性測(cè)定以及分析菌膜穿膜效率等探究復(fù)配抑菌劑的抑菌機(jī)理，以期為研制抑菌聯(lián)合制劑提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門(mén)氏菌（Salmonella choleraesuis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）、毛霉（Mucor wutungkiao）、根霉菌（Rhizopus）、酵母菌（Saccharomycetes）由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院食品加工與活性包裝實(shí)驗(yàn)室提供；肉桂精油 江西省吉水縣益康天然香料油提煉廠。

NB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；碘化丙啶 上海麥克林生化科技有限公司；丙酮酸鈉 阿拉丁試劑（上海）有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 上海源葉生物科技有限公司；寬分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini電泳儀、電泳槽、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；YXQ-LS-18SI自控型手提式滅菌器、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TGL-16gR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HYG-IIa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽的制備及分子質(zhì)量測(cè)定

參考顧晨濤[19]的方法并略作修改，采用酸性蛋白酶酶解魚(yú)鱗，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-15、Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析和纖維素DEAE-52陰離子交換層析分離純化制備草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽，采用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[20]測(cè)定其分子質(zhì)量。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定

采用微量肉湯試管稀釋法[21]測(cè)定魚(yú)鱗抗菌肽和肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。取200 μL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期（1×106CFU/mL）的菌液依次加入稀釋后的試液中，分別得到質(zhì)量濃度梯度256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的魚(yú)鱗抗菌肽試液，32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL的精油試液，每組做3 組平行。以只加入受試菌液為陰性對(duì)照，只加入抗菌肽或精油為陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h，以管中出現(xiàn)彌散渾濁、底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀現(xiàn)象作為菌體生長(zhǎng)觀察指標(biāo)[22]，以無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀的試管所對(duì)應(yīng)濃度為抗菌肽、肉桂精油的最小抑菌濃度。

1.3.3 聯(lián)合抑菌效果評(píng)價(jià)

根據(jù)上述最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果，采用棋盤(pán)稀釋法[23]進(jìn)行聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)。用含吐溫-80的無(wú)菌水稀釋經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾滅菌的肉桂精油，分別得到劑量梯度為4 MIC、2 MIC、1 MIC的肉桂精油乳液（A）。用一定質(zhì)量的草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽配制質(zhì)量濃度梯度為4 MIC、2 MIC、1 MIC的草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽溶液（B）。取9 支含3 mL肉湯培養(yǎng)基的無(wú)菌試管，按照橫排3 管縱列3 管的順序排布，根據(jù)三因子二次正交法復(fù)配后，使得A、B的最終質(zhì)量濃度分布如圖1所示。在各組試管中分別加入200 μL受試菌懸液，漩渦振蕩混勻，細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h，按1.3.2節(jié)法對(duì)各試管內(nèi)菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

圖1 棋盤(pán)稀釋法示意圖Fig.1 Sketch map of checkerboard method

以分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)作為復(fù)配抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)的判定依據(jù)。計(jì)算公式如式（1）所示。

式中：MICA復(fù)配為A和B聯(lián)用時(shí)A對(duì)應(yīng)的最小抑菌濃度；MICB復(fù)配為A和B聯(lián)用時(shí)B對(duì)應(yīng)的最小抑菌濃度；MICA為A單獨(dú)使用時(shí)的最小抑菌濃度；MICB為B單獨(dú)使用時(shí)的最小抑菌濃度。

FIC指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)為：FIC指數(shù)＜0.5時(shí)為協(xié)同作用；0.5＜FIC指數(shù)＜1時(shí)為相加作用；1＜FIC指數(shù)＜2時(shí)為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC指數(shù)＞2時(shí)為拮抗作用。

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示協(xié)同作用的菌株繼續(xù)測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞膜滲透性、胞外乳酸脫氫酶活性變化，并且采用流式細(xì)胞儀分析穿膜效率。

1.3.4 復(fù)配抑菌劑對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

采用分光光度法[24]分析抑菌劑對(duì)受試菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響。將受試菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（1×106CFU/mL），分別加入1/4 MIC復(fù)配抑菌劑，以吐溫-80水溶液作為空白對(duì)照。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組放入搖床中進(jìn)行同步培養(yǎng)，每隔2 h取出對(duì)應(yīng)的試管，振蕩器上振蕩8 s，立即用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm，連續(xù)測(cè)定24 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，平行3 次取平均值。以抑菌時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制復(fù)配抑菌劑作用下受試菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.5 電導(dǎo)率的測(cè)定

用磷酸鹽緩沖液清洗活化后的受試菌體并使之混勻，使復(fù)配抑菌劑在菌懸液中的終質(zhì)量濃度為1 MIC。取5 mL菌懸液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于37 ℃（細(xì)菌）或28 ℃（真菌），120 r/min的搖床中，每隔2 h取樣1 次，離心，取上清液3 mL測(cè)定其電導(dǎo)率[25]。最后121 ℃滅菌20 min，冷卻后離心，測(cè)定上清液的電導(dǎo)率，以不加復(fù)配抑菌劑的吐溫-80水溶液作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。按式（2）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率，以相對(duì)電導(dǎo)率反映細(xì)胞膜滲透性，相對(duì)電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜滲透性越強(qiáng)。

式中：K為某時(shí)刻電解質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率/%；J0為搖床孵育前電導(dǎo)率/（mS/cm）；J1為某時(shí)刻電導(dǎo)率/（mS/cm）；J2為滅菌、冷卻至室溫后電導(dǎo)率/（mS/cm）。

1.3.6 胞外乳酸脫氫酶活力測(cè)定

參考陳惠等[26]方法并略作修改。在復(fù)配抑菌劑中加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試菌株至終質(zhì)量濃度為1 MIC，以不加復(fù)配抑菌劑組為對(duì)照。置于37 ℃（細(xì)菌）、28 ℃（真菌），120 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔4 h取樣，離心（8 000 r/min，10 min），將35 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）用10 mL 0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋?zhuān)玫絅ADH溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。將5.0 mg丙酮酸鈉用58 mL 0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋?zhuān)玫奖徕c溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），并于25 ℃水浴中提前預(yù)熱。取適量0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液于340 nm波長(zhǎng)處調(diào)零后，將10 μL上述離心上清液加入至5.8 mL NADH及0.2 mL丙酮酸鈉溶液中，用紫外-分光光度計(jì)于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值，以吸光度為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以計(jì)算每分鐘吸光度的變化值；通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，再按照公式（3）計(jì)算胞外乳酸脫氫酶的比活力。

式中：L為乳酸脫氫酶比活力/（U/mg）；ΔA340nm/min為每分鐘吸光度變化值；B為稀釋倍數(shù)；V1為上清液體積/μL；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 流式細(xì)胞儀分析菌膜完整性及穿膜效率

將受試菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心（8 000 r/min、10 min），用生理鹽水洗滌2～3 次，再重懸為1×106CFU/mL的菌懸液。加入經(jīng)50 μg/mL碘化丙啶染液標(biāo)記的復(fù)配抑菌劑溶液，至終質(zhì)量濃度為1 MIC，漩渦振蕩混勻[27]。細(xì)菌置于37 ℃、真菌于28 ℃避光孵育2 h，同時(shí)以等體積生理鹽水作陰性對(duì)照。結(jié)束后，離心（8 000 r/min、15 min），用生理鹽水洗滌2～3 次以洗去多余的熒光染料，離心洗滌后用生理鹽水重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)菌體穿膜效率[28]。實(shí)驗(yàn)做3 組平行，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，并用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

將經(jīng)酸性蛋白酶酶解、Sephadex G-15、Sephadex G-50和DEAE-52層析柱分離純化后得到的草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.2 TSDS-PAGE electrophoregram of antimicrobial peptide from grass carp scale

由圖2可知，分離純化后的草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽只顯示出單一條帶，說(shuō)明草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽已達(dá)到電泳純。利用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析得出其分子質(zhì)量約為14.3 kDa。

2.2 聯(lián)合抑菌效果分析

以金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、毛霉、根霉菌、酵母菌為受試菌，測(cè)定草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油聯(lián)合抑菌效果，結(jié)果如表1所示。草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的MIC為16 μg/mL，對(duì)副溶血性弧菌、大腸桿菌、產(chǎn)黃青霉的MIC為32 μg/mL，對(duì)黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的MIC為64 μg/mL，表現(xiàn)出廣譜抑菌活性。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌及沙門(mén)氏菌等革蘭氏陰性菌的抑菌效果相較于Li Chunlei等[29]所研究的AI-Hemocidin 2抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌的抑菌效果（MIC為37.5～300.0 μg/mL）好；且抑菌效果明顯優(yōu)于王潔等[30]所研究的Cn-AMP2抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌的抑菌效果（MIC為50～100 μg/mL）。

表1 抗菌肽和肉桂精油聯(lián)合抑菌MIC及聯(lián)合效果評(píng)價(jià)Table 1 Minimal inhibitory concentration and antimicrobial effects of antimicrobial peptide combined with cinnamon essential oil

肉桂精油對(duì)受試細(xì)菌的MIC范圍為2～4 μL/mL，對(duì)真菌的MIC為4 μL/mL。相較于王一非等[31]研究所得留蘭香微乳體系對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌的MIC為8～32 μL/mL，肉桂精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性。

草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油聯(lián)用時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)黃青霉的FIC指數(shù)分別為0.375、0.5、0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用；對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的FIC指數(shù)大于0.5，表現(xiàn)為相加作用；對(duì)所有受試菌均無(wú)拮抗作用。復(fù)配抑菌劑中魚(yú)鱗抗菌肽MIC范圍為4～32 μg/mL，肉桂精油為0.5～2.0 μL/mL，均優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

2.3 復(fù)配抑菌劑對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

圖3 肉桂精油復(fù)配劑對(duì)受試菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.3 Effect of antimicrobial combination on growth curve of tested strains

由圖3可以看出，復(fù)配劑對(duì)受試菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)產(chǎn)生了不同程度的影響。在0～2 h內(nèi)，空白組與加樣組菌體的生長(zhǎng)速率相差不明顯，2～16 h加樣組生長(zhǎng)速率明顯較慢，16～24 h內(nèi)兩組的菌體生長(zhǎng)速率都有所減慢，且樣品組減慢的速率更快，該現(xiàn)象與盧曉等[32]研究發(fā)現(xiàn)0.2 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響相似。可能是復(fù)配抑菌劑的存在一定程度上影響了受試菌的生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短、衰亡期加快以及生長(zhǎng)速率緩慢，從而達(dá)到抑菌作用。

2.4 復(fù)配抑菌劑對(duì)細(xì)胞膜滲透性分析結(jié)果

圖4 肉桂精油復(fù)配劑對(duì)受試菌細(xì)胞膜滲透性的影響Fig.4 Effect of antimicrobial combination on cell membrane permeability of tested strains

由圖4可以看出，加入復(fù)配抑菌劑的菌體細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組，在處理2 h后相對(duì)電導(dǎo)率變化明顯加快，8 h后變化相對(duì)減緩。這說(shuō)明在抑菌劑的作用下，細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變，使胞內(nèi)鉀離子、鈉離子等電解質(zhì)的不斷外漏，相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)增加。而經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的處理后，由于大量離子的丟失導(dǎo)致菌體胞內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境被破壞，相對(duì)電導(dǎo)率變化減緩。本實(shí)驗(yàn)中4～8 μg/mL魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油復(fù)配對(duì)各受試菌相對(duì)電導(dǎo)率為50%～75%，與劉俊義等[33]所研究的0.45～0.50 mg/mL文冠果種仁甾醇相比效果更明顯（對(duì)受試菌相對(duì)電導(dǎo)率為25%～35%）。

2.5 復(fù)配抑菌劑對(duì)胞外乳酸脫氫酶活力分析結(jié)果

圖5 肉桂精油復(fù)配劑對(duì)受試菌乳酸脫氫酶比活力的影響Fig.5 Effect of antimicrobial combination on lactic dehydrogenase specific activity of tested strains

由圖5可知，加樣組的胞外乳酸脫氫酶比活力均明顯高于對(duì)照組，在4～12 h內(nèi)胞外乳酸脫氫酶比活力增加明顯，12 h后相對(duì)減緩。可能是抑菌劑作用于受試菌體細(xì)胞膜上的某些靶點(diǎn)，使得細(xì)胞膜受到一定程度的損傷后原先存在于細(xì)胞質(zhì)中的乳酸脫氫酶外泄至膜外。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，由于胞內(nèi)的乳酸脫氫酶不斷地溢出，嚴(yán)重影響了細(xì)胞正常的糖酵解及呼吸代謝過(guò)程，從而達(dá)到了抑菌作用。

2.6 復(fù)配抑菌劑對(duì)菌膜穿膜效率分析結(jié)果

圖6 流式細(xì)胞儀分析復(fù)配抑菌劑處理對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞的影響Fig.6 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Staphylococcus aureus cells

圖7 流式細(xì)胞儀分析復(fù)配抑菌劑處理對(duì)產(chǎn)黃青霉細(xì)胞的影響Fig.7 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Penicillium chrysogenum cells

圖8 流式細(xì)胞儀分析復(fù)配抑菌劑處理對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞的影響Fig.8 Flow cytometry analysis of the effect of antimicrobial combination on Vibrio parahaemolyticus cells

由圖6～8可知，經(jīng)復(fù)配抑菌劑處理的金黃色葡萄球菌穿膜效率達(dá)到了72.76%，與單獨(dú)使用肉桂精油（57.61%）、魚(yú)鱗抗菌肽（38.16%）相比有明顯差異。產(chǎn)黃青霉穿膜效率達(dá)到了61.56%，與單獨(dú)肉桂精油（51.04%）、魚(yú)鱗抗菌肽（30.08%）相比有明顯差異。副溶血性弧菌穿膜效率達(dá)到了51.04%，與單獨(dú)使用肉桂精油（49.45%）、魚(yú)鱗抗菌肽（37.05%）相比，有一定提升效果。與盧佳等[34]所研究的少棘蜈蚣抗菌肽Scolopin 2-NH2（穿膜效率41.28%、43.05%）相比抑菌效果明顯。

可見(jiàn)，草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油復(fù)配劑對(duì)于產(chǎn)黃青霉、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌抑制效果明顯，且比單獨(dú)使用時(shí)增效明顯。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明分子質(zhì)量約為14.3 kDa的草魚(yú)魚(yú)鱗抗菌肽與肉桂精油聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)黃青霉表現(xiàn)為協(xié)同作用；對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌表現(xiàn)為相加作用，對(duì)所有受試菌均無(wú)拮抗作用。復(fù)配抑菌劑的抑菌機(jī)理可能是通過(guò)影響菌體的生長(zhǎng)周期，致使菌體出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的縮短以及衰亡期的加快；通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性，使得胞內(nèi)電解質(zhì)物質(zhì)、乳酸脫氫酶不斷地溢出到胞外，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制進(jìn)而導(dǎo)致死亡。但其具體的抑菌機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究，希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転檫M(jìn)一步研究抗菌肽與精油復(fù)配劑的抑菌機(jī)制和開(kāi)發(fā)高效安全、綠色環(huán)保的抑菌劑提供理論依據(jù)。