抗菌肽PAF26對(duì)采后李果實(shí)褐腐菌的抑菌效果及機(jī)理

蔡 蜨，李心丹，鄧麗莉,3，曾凱芳,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（西南大學(xué)），重慶 400715；3.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

李子是薔薇科植物李的果實(shí)，我國大部分地區(qū)均產(chǎn)[1]。李果實(shí)成熟于夏季高溫季節(jié)[2-3]，是一種高度易腐、采后壽命短的農(nóng)產(chǎn)品[4]。李果實(shí)采后腐爛造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[5]，其中，較為嚴(yán)重的是褐腐病，且主要致病菌是美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola（Winter）Honey）[6]。核桃腐病菌（M.fructicola）具有很快的生長速度和傳播速度[7-8]，病原體會(huì)感染田間的花、嫩枝和果實(shí)，并產(chǎn)生包括花苞凋謝、木質(zhì)組織潰爛和果實(shí)腐爛等各種癥狀，普遍的損害發(fā)生在貯藏和運(yùn)輸?shù)牟珊箅A段[9]。在現(xiàn)有的李果實(shí)褐腐病的防治中，化學(xué)殺菌劑的使用是最普遍、也是最有效的，如過氧乙酸[3]、1-甲基環(huán)丙烯、戊唑醇[10]和L-半胱氨酸[5]處理等。但化學(xué)殺菌劑的長期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生一定的抗性，且化學(xué)殺菌劑本身會(huì)給環(huán)境和人體健康帶來潛在威脅，因此研究者們開始致力于尋找環(huán)保、無污染、安全有效的物質(zhì)來減少或代替化學(xué)殺菌劑的大量使用。

抗菌肽又可稱為抗微生物肽，一般是指由生物有機(jī)體產(chǎn)生的一種具有較廣抗菌譜或防御功能的小分子肽類物質(zhì)[11-12]，可以非特異性地抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體[13]。抗菌肽可通過與細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的特異性結(jié)合，干擾細(xì)胞代謝從而達(dá)到滅菌和殺菌的效果[14]。除此之外，抗菌肽也能通過改變細(xì)胞膜的通透性使細(xì)胞死亡[15]。近年來，抗菌肽具有的作用快速、安全、無殘留以及不耐藥等特點(diǎn)使其在醫(yī)藥業(yè)、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[15-16]。抗菌肽PAF26（Ac-RKKWFW-NH2）是一種針對(duì)植物病原青霉病被組合、篩選、鑒定出的富含色氨酸的陽離子小分子合成六肽，與其他天然或合成來源的抗微生物肽具有序列相似性[17-20]。目前國外已有研究表明，PAF26能夠有效對(duì)柑橘類水果病害進(jìn)行控制[21-22]，但有關(guān)PAF26在其他果蔬采后病害控制方面鮮有報(bào)道，也鮮見將抗菌肽PAF26應(yīng)用于李果實(shí)采后病害控制的有關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探究抗菌肽PAF26對(duì)李果實(shí)采后褐腐病病原菌M.fructicola的抑菌效果和作用機(jī)理，從而拓寬抗菌肽PAF26的應(yīng)用范圍，并且為李果實(shí)采后病害的控制提供一種新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

M.fructicola為本實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定和保存的菌種。使用前將菌懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，并于25 ℃條件下培養(yǎng)。5 d后挑選生長旺盛的菌絲再次接種在PDA培養(yǎng)基，于25 ℃下培養(yǎng)7 d。在無菌條件下，用無菌水將M.fructicola洗下配制成高濃度的孢子懸浮液，并根據(jù)需要用無菌水調(diào)至到所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

‘青脆李’（Prunus salicinaLindell cv.‘Qingcui’）采摘于重慶市巫山縣，采摘后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選無病害、無機(jī)械傷且大小均勻、成熟度一致的果實(shí)。攤平去除田間熱后，于室溫條件下貯藏待用。

純度大于90%的抗真菌肽PAF26（Ac-RKKWFWNH2）（固相合成方法合成）購于南京金斯瑞公司，貯藏在-40 ℃冰箱中，使用前先用無菌水配成4 mmol/L的母液，然后稀釋至所需濃度。SYTOX Green（SG）熒光染色劑 美國Invitrogen 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 重慶思美特科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SYNERGYH1MG全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；TS100熒光顯微鏡 北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola的離體抑菌作用分析

實(shí)驗(yàn)參考Wang Wenjun等[23]的方法并進(jìn)行一定修改。使用無菌96 孔微量板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將180 μL 1×104CFU/mLM.fructicola孢子懸浮液（含體積分?jǐn)?shù)5%馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）與20 μL抗菌肽PAF26溶液，混合后立即加入96 孔板中，使PAF26的終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L和128 μmol/L。對(duì)照組以無菌水代替抗菌肽，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h時(shí)用酶標(biāo)儀測定其OD600nm。以48 h依舊能完全抑制病原菌生長的最低濃度作為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

將180 μL無菌水稀釋的M.fructicola孢子懸浮液（1×103CFU/mL）和20 μL已測出的具有抑菌濃度的抗菌肽（實(shí)驗(yàn)組）或無菌水（對(duì)照組）在1.5 mL的離心管中混合。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h后從離心管中吸取50 μL液體涂布在PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU）來確定分生孢子的生存能力。將抗菌肽PAF26處理后的分生孢子存活率與對(duì)照組進(jìn)行比較。按公式（1）計(jì)算分生孢子存活率。每一濃度3 組平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 同孔損傷接種抗菌肽PAF26對(duì)李果實(shí)褐腐菌的控制效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考Mu?oz等[24]的方法并進(jìn)行一定修改。用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉浸泡李果實(shí)1 min后用清水沖洗，并于常溫下自然晾干。果實(shí)表面赤道部位經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭消毒后，將其隨機(jī)分成3 組，每組15 個(gè)果實(shí)。用滅菌鐵釘在果實(shí)赤道部位等距打兩個(gè)孔（深3 mm、直徑3 mm）。將10 μL新鮮孢子懸浮液（1×104CFU/mL）和10 μL抗菌肽混合后立即接種于孔中。以無菌水代替抗菌肽為對(duì)照使抗菌肽PAF26的終濃度為64、128 μmol/L。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋將果實(shí)單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度為80%～90%的環(huán)境中貯藏，統(tǒng)計(jì)第3～6天的發(fā)病率并測量病斑直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 抗菌肽對(duì)M.fructicola細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

1.3.3.1M.fructicola菌絲細(xì)胞膜完整性的測定

實(shí)驗(yàn)參考Wang Wenjun等[23,25]的方法并進(jìn)行一定修改。用體積分?jǐn)?shù)為5%的PDB配制1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，取90 μL加入到無菌的1.5 mL的離心管中，25 ℃下培養(yǎng)24 h。然后，加入10 μL抗菌肽溶液或無菌水（對(duì)照組），使抗菌肽PAF26的終濃度達(dá)到0、64、128 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后加入4 μmol/L SG貯備溶液，使其終濃度達(dá)到0.2 μmol/L，樣品繼續(xù)在暗環(huán)境下培養(yǎng)5 min后，挑取菌絲制片并在熒光顯微鏡下觀察，條件設(shè)置：SG的檢測激發(fā)波長450～490 nm、發(fā)射波長515～565 nm；濾光片選擇為異硫氰酸熒光素。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3.2M.fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的測定

實(shí)驗(yàn)參考Li Xindan等[26]的方法并進(jìn)行一定修改。將90 μL的1×107CFU/mL的病原菌孢子懸浮液加入到無菌的1.5 mL離心管中，然后加入10 μL抗菌肽，使抗菌肽在混合液中的終濃度分別達(dá)到0、64、128 μmol/L，以無菌水代替抗菌肽為對(duì)照，置于25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h，加入500 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）貯備溶液，使混合液中PI的終質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/L，制片并在熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。熒光顯微鏡下檢測并拍照：PI的檢測（激發(fā)波長設(shè)置為535 nm、發(fā)射波長為615 nm）；濾光片選擇G-2A。每張載玻片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，在明視野以及相同位置的熒光視野下分別拍照記錄。將明視野中觀察到的孢子數(shù)定義為總數(shù)（T），熒光視野下觀察到紅色的染色孢子作為已被破壞膜結(jié)構(gòu)的孢子數(shù)（S）。按照公式（2）計(jì)算孢子細(xì)胞膜完整性。

1.3.3.3M.fructicola菌絲體胞外電導(dǎo)率的測定

實(shí)驗(yàn)參考Paul等[27]的方法并進(jìn)行一定的修改。采用DDS-307A電導(dǎo)率儀測定M.fructicola胞外電導(dǎo)率。將100 μL 1×105CFU/mL病原菌孢子懸浮液加入到20 mL PDB培養(yǎng)基中，在25 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)48 h且含菌絲體的PDB培養(yǎng)基在4 000×g的條件下離心15 min，獲得的菌絲體沉淀再在相同離心條件下用無菌水離心沖洗3 次。收集菌絲體沉淀，重懸于無菌水中。加入抗菌肽溶液，使其終濃度分別為0、64、128 μmol/L，以無菌水代替抗菌肽溶液為對(duì)照。在處理0、0.5、1、2、3、6 h和9 h 時(shí)測定胞外電導(dǎo)率。每一濃度3 組平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 抗菌肽PAF26溶血性測定

實(shí)驗(yàn)參考Mu?oz等[28]的方法并進(jìn)行一定修改。將從西南大學(xué)南區(qū)校醫(yī)院獲得的健康成人新鮮血液混合到含有抗凝血?jiǎng)┑碾x心管中，1 000×g離心5 min，棄上清液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，然后用4 倍體積PBS重懸，獲得紅細(xì)胞懸浮液。取10 μL濃度分別64、128 μmol/L的抗菌肽溶液或0.1 mol/L PBS（陰性對(duì)照）、0.1% Triton X-100（陽性對(duì)照），與90 μL紅細(xì)胞懸浮液混合后于37 ℃培養(yǎng)1 h。然后1 000×g離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至無菌的96 孔微量板，用酶標(biāo)儀測定540 nm波長處的OD值。每一濃度3 組平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式（3）計(jì)算溶血率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用GraphPad Prism 8軟件繪圖；用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola的離體抑菌作用

由圖1A可知，當(dāng)PAF26的濃度為64 μoml/L時(shí)，M.fructicola生長完全受抑制，即抗菌肽PAF26的MIC為64 μmol/L。由圖1B、C可知，與對(duì)照相比，濃度為64、128 μmol/L的抗菌肽能夠顯著降低分生孢子存活率（P＜0.05），且64 μmol//L PAF26降低M.fructicola孢子存活率的能力顯著強(qiáng)于128 μmol/L PAF26（P＜0.05）。

圖1 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola的離體抑菌作用Fig.1 Antifungal activity in vitro of peptide PAF26 on M.fructicola

2.2 抗菌肽PAF26對(duì)李果實(shí)褐腐菌的控制效果

如圖2A所示，經(jīng)同孔損傷接種后，處理3～6 d內(nèi)，PAF26處理過的果實(shí)發(fā)病率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且64 μmol/L處理明顯比128 μmol/L處理效果好。如圖2B所示，處理的第3、4、6天，PAF26處理過的果實(shí)病斑直徑與對(duì)照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。但在處理第5天時(shí)，64 μmol/L處理過的果實(shí)病斑直徑顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）。如圖2C所示，處理6 d后，經(jīng)64、128 μmol/L抗菌肽處理后的李果實(shí)發(fā)病孔數(shù)明顯少于對(duì)照組，而病斑直徑無明顯差別，與發(fā)病率和病斑直徑的測定結(jié)果一致。

圖2 抗菌肽PAF26對(duì)李果實(shí)采后褐腐菌發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig.2 Effect of peptide PAF26 on disease incidence and lesion diameter of plum fruit caused by M.fructicola

2.3 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola菌絲細(xì)胞膜的影響

圖3 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola菌絲體細(xì)胞膜的影響Fig.3 Effect of peptide PAF26 on membrane permeability of M.fructicola mycelia

當(dāng)細(xì)胞膜通透性被破壞后，SG熒光染色劑可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，呈現(xiàn)出大于未結(jié)合核酸物質(zhì)時(shí)500 倍強(qiáng)度的綠色熒光。如圖3所示，未經(jīng)PAF26處理的對(duì)照組的M.fructicola菌絲經(jīng)SG染色后，沒有出現(xiàn)明顯的綠色熒光；經(jīng)過濃度為64、128 μmol/L的抗菌肽處理過后的實(shí)驗(yàn)組，呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光。表明經(jīng)抗菌肽處理后的M.fructicola菌絲細(xì)胞膜已被破壞。

2.4 抗菌肽PAF26處理對(duì)M.fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的影響

圖4 抗菌肽PAF26處理對(duì)M.fructicola孢子細(xì)胞膜的影響Fig.4 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane permeability of M.fructicola spores

圖5 抗菌肽PAF26處理對(duì)M.fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of peptide PAF26 treatment on membrane integrity of M.fructicola spores

當(dāng)M.fructicola孢子細(xì)胞膜破損后，PI熒光染色劑可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，發(fā)出紅光。由圖4可知，對(duì)照組并未發(fā)現(xiàn)發(fā)出紅光的細(xì)胞，經(jīng)濃度為64、128 μmol/L的抗PAF26菌肽處理后，均發(fā)現(xiàn)發(fā)出紅光的細(xì)胞。且由圖5可知，對(duì)照組的M.fructicola孢子細(xì)胞膜完整性基本保持在100%，而經(jīng)過64、128 μmol/L PAF26處理后M.fructicola孢子細(xì)胞膜完整性均降低至85%左右，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.5 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola菌絲體胞外電導(dǎo)率的影響

如圖6所示，隨著處理時(shí)間的延長，對(duì)照組和PAF26的兩個(gè)不同濃度處理組的M.fructicola菌絲體胞外電導(dǎo)率都逐漸增大。且經(jīng)兩個(gè)不同濃度的PAF26處理后胞外電導(dǎo)率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在處理9 h后，對(duì)照和64、128 μmol/L PAF26處理組胞外電導(dǎo)率達(dá)到最大，分別為51.60 μS/cm和63.50、89.03 μS/cm。

圖6 抗菌肽PAF26對(duì)M.fructicola菌絲體胞外電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of peptide PAF26 treatment on extracellular conductivity of M.fructicola mycelia

2.6 抗菌肽PAF26溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7 抗菌肽PAF26的溶血性Fig.7 Hemolytic activity of peptide PAF26

實(shí)驗(yàn)以0.1 mol/L PBS作為陰性對(duì)照，不會(huì)導(dǎo)致溶血現(xiàn)象發(fā)生，以0.1% Triton X-100作為陽性對(duì)照，有極強(qiáng)的溶血性。如圖7所示，兩個(gè)濃度的抗菌肽PAF26的溶血率均顯著低于0.1% Triton X-100（P＜0.05），且128 μmol/L PAF26溶血率顯著低于64 μmol/L PAF26（P＜0.05）。當(dāng)PAF26濃度為64、128 μmol/L時(shí)，溶血率分別為1.62%、0.96%。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以探究抗菌肽PAF26對(duì)李果實(shí)采后褐腐菌的抑菌效果為目的，進(jìn)而研究PAF26的作用機(jī)理。結(jié)果表明，抗菌肽PAF26在離體條件下對(duì)李果實(shí)褐腐病病原菌M.fructicola具有一定的抑菌效果，其中MIC為64 μmol/L，該濃度下能夠顯著降低孢子存活率，但不能完全殺菌，這與LfcinB20-25的作用效果[29]相似。不同濃度PAF26的抑菌效果表現(xiàn)出差異，但濃度增到128 μmol/L后抑菌效果反而沒有64 μmol/L好，這與乳鐵蛋白原肽的抑菌效果[29]相似。這樣的結(jié)果很有可能是因?yàn)殡牡臐舛却嬖谟行Х秶Ｔ诠麑?shí)的同孔接種實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PAF26能夠顯著抑制李果實(shí)M.fructicola導(dǎo)致的發(fā)病率，但對(duì)病斑直徑影響不大。這與前人發(fā)現(xiàn)抗菌肽PAF26具有一定的抗真菌活性，能在體外特異性靶向和抑制絲狀真菌的結(jié)果[17,30]相似。

通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)抗菌肽PAF26能夠增加M.fructicola菌絲體細(xì)胞膜的通透性，使SG進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，這一結(jié)果與前人所描述的抗菌肽可通過破壞細(xì)胞膜通透性從而達(dá)到抑菌和殺菌效果的結(jié)論[31]相似。通過熒光顯微鏡觀察，還發(fā)現(xiàn)PAF26處理可破壞M.fructicola孢子細(xì)胞膜，使PI染色劑進(jìn)入孢子內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，發(fā)出紅光，從而延緩M.fructicola孢子的萌發(fā)，這與前人所研究的抗菌肽O3RT和C12O3TR可引起細(xì)胞滲透平衡的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的作用機(jī)理[26]相似。細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，它保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。細(xì)胞損傷的早期表現(xiàn)[6]表明當(dāng)其通透性發(fā)生異常變化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物大量泄漏從而影響細(xì)胞的正常生理活性。抗菌肽PAF26處理可顯著增加菌絲體胞外電導(dǎo)率，促使其菌絲體膜內(nèi)物質(zhì)泄漏，這一結(jié)果表明菌絲體細(xì)胞膜在一定程度上受到破壞，這與PAF56[23]、BP21[25]的作用效果相似。由于某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性和溶血性等缺陷[32-33]，在一定程度上限制了抗菌肽的應(yīng)用。但本研究表明，抗菌肽PAF26具有特異性細(xì)胞溶解活性，對(duì)人血紅細(xì)胞幾乎不存在溶解性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這與PAF26溶血性結(jié)果[28]相似。

綜上，抗菌肽PAF26可以通過增加M.fructicola菌絲細(xì)胞膜通透性和破壞M.fructicola孢子細(xì)胞膜，引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而達(dá)到對(duì)M.fructicola生長的抑制。PAF26幾乎不存在溶血現(xiàn)象，是一種比較環(huán)保、高效的抗菌肽。因此認(rèn)為，抗菌肽PAF26在李果實(shí)采后褐腐菌的抑制方面具有很大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。