高氧氣調包裝對宰后牛半膜肌成熟過程中品質的影響

扶慶權，王海鷗，李 坤，楊 平，陳全戰(zhàn)，王婷婷

（1.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171；2.河北豐科生物科技有限公司，河北 秦皇島 066000）

高氧氣調包裝是底部采用一個聚乙烯塑料托盤，在包裝盒內(nèi)充入一定比例的混合氣體（70%（體積分數(shù)，下同）～80% O2和20%～30% CO2或N2）置換包裝盒內(nèi)的空氣，上面再采用具有氣體阻隔性能的包裝材料進行密封所制成的包裝[1]。高氧氣調包裝能夠抑制微生物的生長，有效延長產(chǎn)品貨架期，還能較長時間能保持鮮肉顏色的穩(wěn)定性，因此一些西方國家常選用高氧氣調包裝方式對鮮肉進行保鮮[2]。然而，高氧氣調包裝在貯藏期間由于氧氣含量高加速了氧化過程，引起蛋白質氧化和脂肪氧化，而脂肪氧化由于氫過氧化物分解產(chǎn)生小分子酮類和醛類物質產(chǎn)生異味引起鮮肉酸敗和肌紅蛋白的氧化[3]；蛋白質氧化能夠引起蛋白質的結構修飾并降低鮮肉的質構性質[4]，從而降低鮮肉的食用品質和營養(yǎng)價值[5-6]。

嫩度和顏色是評價牛肉宰后成熟過程中最重要的兩個品質指標，其中顏色與氧氣含量密切相關，也有研究指出鮮肉表面顏色和鮮肉的嫩度顯著相關[7]。而嫩度與牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白結構的完整性密切相關[8]，一些肌球蛋白、肌鈣蛋白-T、肌腱線蛋白、伴肌動蛋白等關鍵結構蛋白的降解和破壞有利于改善牛肉的嫩度。研究表明，肌原纖維蛋白的降解是鮮肉嫩化的主要作用機制，但是肌原纖維蛋白的降解受到蛋白質氧化修飾的調節(jié)[9]。在牛肉冷藏成熟過程中，蛋白質氧化和脂肪氧化是調控牛肉產(chǎn)品品質的一個重要因素，尤其是不同包裝方式下蛋白質氧化和脂肪氧化對牛肉的嫩度和顏色的改善起著非常重要的作用。

然而，高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中品質影響的內(nèi)在機理目前還鮮有報道，本實驗以東北‘西門塔爾’母黃牛為研究對象，從脂肪氧化、蛋白質氧化和蛋白降解的角度闡述其對牛肉品質影響的潛在機制，為生產(chǎn)企業(yè)科學使用不同包裝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料選取在東北養(yǎng)殖的‘西門塔爾’母黃牛（活體質量約260 kg，20 月齡）4 頭，均在阜陽雨潤食品有限公司按標準程序屠宰，經(jīng)過去頭、去皮、四肢和內(nèi)臟等一系列工序后胴體于4 ℃冷庫排酸24 h，排酸結束后取整塊半膜肌備用。

肌鈣蛋白-T單克隆抗體 美國西格瑪奧德里奇公司；羊抗兔免疫球蛋白抗體、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 美國密理博公司；牛血清白蛋白美國普洛麥格公司；電化學發(fā)光試劑盒 美國賽默飛公司；2,4-二硝基苯肼 上海阿拉丁試劑有限公司；兔血清、CY3羊抗兔免疫球蛋白 武漢博士得生物工程有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）多克隆抗體 英國Abcam公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

DC800型真空包裝機 美國快爾衛(wèi)包裝公司；S500高氧氣調包裝機 西班牙屋瑪公司；Avanti J-E型高速離心機 美國貝克曼庫爾特公司；Turrax T25型高速勻漿機 德國艾卡公司；AUW120電子天平 日本島津儀器公司；TA-XT2i型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；CR-400型色差儀 日本美能達公司；TW20型水浴鍋 德國優(yōu)萊博公司；熱電偶溫度計 美國Omega公司；Imagescanner凝膠成像儀 美國GE公司；Spectra M2型酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司；LSM 700 META激光共聚焦顯微鏡 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

排酸后的牛半膜肌樣品立即用不銹鋼刀切成大小基本相同的長方形肉塊（約500 g/塊），每頭牛肉隨意取一定數(shù)量的肉塊分別進行高氧氣調包裝（80% O2＋20% CO2）和真空包裝，包裝結束后放入4 ℃冰箱中貯藏成熟，在0、4、7、10 d時取樣測定相關指標。

1.3.2 剪切力測定

剪切力的測定參考Lagerstedt等[10]的方法并進行適當?shù)男薷摹Ｅ０肽ぜ∠惹谐纱笮∫恢碌拈L方形肉塊，將熱電偶溫度計插入肉塊中間后置于蒸煮袋，放在75 ℃的水浴鍋中蒸煮，當肉塊的中心溫度達到70 ℃時立即取出，用流動自來水進行冷卻至室溫。將樣品沿著肌纖維方向切成1 cm×1 cm×6 cm大小的長方形肉條，使用質構儀垂直肌纖維方向測定其剪切力。測定條件：探頭型號HDP/BS，觸發(fā)力50 g，測定前、后速率5 mm/s，測定速率2 mm/s，下壓距離2 mm，常溫測定。每個處理組取3 個肉塊進行測定，每個肉塊取6 個肉條平行測定。

1.3.3 表面肉色測定

牛半膜肌表面顏色L*（亮度）、a*（紅度）和b*（黃度）值使用色差儀進行測定。測定前色差儀使用白瓷板進行校正。測定條件：D65光源，孔徑8 mm，視角10°。打開包裝后用濾紙擦干牛肉表面的水分，在其表面不同位置均勻地取點測定。每個處理組取3 個肉塊進行測定，每個肉塊在其表面不同位置測定5 次。

1.3.4 脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白相對含量測定

脫氧肌紅蛋白（deoxy-myoglobin，DMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxgMb）和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）相對含量的測定參考Krzywicki[11]的方法。每個處理組取3 個肉塊進行測定，每個肉塊在其表面不同位置測定5 次。DMb、OxgMb、MetMb相對含量分別按公式（1）～（3）計算。

1.3.5 肌漿蛋白、總蛋白溶解度測定

蛋白溶解度的測定參考Joo等[12]的方法并進行適當修改。分別稱取1 g已打碎的肉樣2 份，一份加入預冷的磷酸鹽緩沖液（10 mL 0.025 mol/mL，pH 7.2）用于測定肌漿蛋白溶解度；另外一份加入含1.1 mol/mL碘化鉀的磷酸鹽緩沖液（20 mL 0.01 mol/mL，pH 7.2）用于測定總蛋白溶解度。用勻漿機以2 500 r/min勻漿1 min，然后2 000×g離心20 min，濾紙過濾后取上清液，用雙縮脲法測定溶液的蛋白質量濃度。每個處理組取3 個肉塊，每個肉塊取3 個樣品平行測定。溶解度按式（4）計算。

式中：V表示緩沖液體積/mL；m表示樣品質量/g；ρ表示蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 肌細胞中羰基分布測定

肌細胞中羰基分布測定參照Astruc等[13]的免疫染色法。牛肉樣品沿著肌纖維方向切成長約2 cm的細長條，使用液氮冷凍60 s脫水，切片機切成10 μm厚的薄片后置于載玻片上，加入1 mL 0.2 g/100 mL的2,4-二硝基苯肼溶液（溶劑為含0.1 mol/L NaCl的pH 6.0、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液），放置暗處室溫反應16 h，使用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含體積分數(shù)0.1%吐溫20、0.1 mol/L氯化鈉，pH 6.75）洗滌6 次，每次洗滌5 min。使用體積分數(shù)10%的兔血清在37 ℃條件下封閉1 h，分別使用一抗（DNPH多克隆抗體）和二抗（CY3羊抗兔免疫球蛋白）孵育14 h和1 h，每次取出后均需使用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌6 次，每次洗滌5 min。使用激光共聚焦顯微鏡觀察羰基在牛肉肌細胞中的分布情況。激光共聚焦測定條件：發(fā)射波長570 nm，激發(fā)波長555 nm，放大200 倍，曝光時間3 s。

1.3.7 硫代巴比妥酸反應物值測定

硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值測定參照王超等[14]的方法。取5 g預先打碎的半膜肌樣品置于離心管中，加入20 g/100 mL的三氯乙酸溶液25 mL，2 500 r/min勻漿1 min后于2 000×g離心20 min，過濾定容50 mL得勻漿液。分別取2 mL溶液作為空白對照和實驗組，在空白對照組中加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，在實驗中加入2 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴保溫20 min后流水冷卻5 min，使用分光光度計在510 nm波長處測吸光度。用1 mol/L 1,1,3,3-丙二醛溶液作標準曲線，結果以每千克肉中所含的丙二醛質量表示，單位為mg/kg。每個處理組取3 個肉塊進行測定，每個肉塊取3 個樣品平行測定。

1.3.8 肌鈣蛋白-T降解率的測定

肌原纖維蛋白的提取參考Park等[15]的方法。采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，并將肌原纖維蛋白質量濃度最終調整為4 mg/mL，分裝在100 μL離心管后于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谑榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

參考Fu Qingquan等[16]的免疫印跡法測定肌鈣蛋白-T的免疫熒光強度。采用質量分數(shù)4%的濃縮膠和質量分數(shù)10%的分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后立即在4 ℃條件下90 V電壓轉印120 min，轉印后的PVDF膜放入20 mmol/L Tris-base緩沖液（含5 g/100 mL脫脂奶粉、137 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、體積分數(shù)0.05%吐溫20，下同）中孵育封閉2 h。封閉后的PVDF膜在一抗和二抗溶液中分別孵育15 h和2 h，每次孵育后均需用20 mmol/L Tris-base緩沖液洗滌6 次。取出膜用增強化學發(fā)光顯色劑在暗處顯色5 min后立即用凝膠成像儀進行拍照。肌鈣蛋白-T的條帶強度用Quantity one軟件進行定量分析。肌鈣蛋白-T降解率按公式（5）進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 8.2軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，結果以平均值±標準差表示，單因素方差分析采用韋爾奇的權重方差分析，差異顯著性分析均采用鄧肯氏多重比較方法，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中剪切力的影響

圖1 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中剪切力的影響Fig.1 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on shear force of beef during postmortem aging

嫩度是評價牛肉很重要的品質指標，也是牛肉非常關鍵的感官特征之一，它直接影響消費者的接受性和二次購買欲望[8]。剪切力是反映鮮肉嫩度最直接的指標，剪切力越小說明鮮肉的嫩度越高[17]。由圖1可知，在宰后成熟過程中，高氧氣調包裝牛肉樣品的嫩度顯著低于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05），表明高氧氣調包裝不利于牛肉嫩度的改善，其原因很可能與高氧條件下引起的牛肉蛋白質氧化加劇有關，蛋白氧化過程中抑制了牛肉本身μ-鈣激活酶的活性從而抑制了其對細胞結構蛋白的降解速率[16]。Zakrys-Waliwaner等[18]研究也發(fā)現(xiàn)高氧氣調包裝牛排的嫩度在14 d成熟過程中顯著低于真空包裝的牛排樣品（P＜0.05），與本研究結果類似。

2.2 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中肉色的影響

顏色是消費者用來評價鮮肉品質的首要指標，它直接影響消費者的購買欲望[19]。如圖2所示，宰后成熟過程中高氧氣調包裝的牛肉樣品L*、a*值和b*值顯著高于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05）。高氧氣調包裝牛肉相對于真空包裝樣品L*值的增加可能是由蛋白質氧化或交聯(lián)聚集引起的，尤其是高氧條件下氧氣會引起光散射從而增加鮮肉的L*值[20]。而高氧氣調包裝牛肉的a*值較高可能是氣調包裝中高濃度的氧使DMb氧化形成OxgMb，OxgMb覆蓋在MetMb的表層，從而較長時間保持了OxgMb本身的亮紅色[21]。Jayasingh等[22]采用了類似的方法研究牛肉的顏色變化，發(fā)現(xiàn)高氧氣調包裝的牛肉在成熟10 d過程中其a*值顯著高于真空包裝的牛肉樣品，說明高氧氣調包裝更有利于顏色的改善。Resconi等[23]也研究表明，高氧氣調包裝（80% O2）有利于維持牛肉較高a*值，即維持較高的色澤穩(wěn)定性，色澤變化趨勢與本研究結果相似。

圖2 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中肉色的影響Fig.2 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on color of beef during postmortem aging

2.3 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中DMb、OxgMb、MetMb相對含量的影響

由圖3可知，宰后成熟過程中，高氧氣調包裝牛肉樣品的DMb和OxgMb相對含量顯著低于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05），而高氧氣調包裝牛肉樣品的MetMb相對含量顯著高于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05）。這說明隨著成熟時間的延長，高氧氣調包裝的牛肉樣品在高濃度氧條件下，DMb和OxgMb不斷轉化為MetMb，導致DMb和OxgMb相對含量不斷減少，而MetMb相對含量不斷增加。

圖3 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中DMb（A）、OxgMb（B）和MetMb（C）相對含量的影響Fig.3 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on DMb (A),OxgMb (B) and MetMb (C) contents of beef during postmortem aging

2.4 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中蛋白溶解性的影響

圖4 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中肌漿蛋白（A）和總蛋白（B）溶解度的影響Fig.4 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on sarcoplasmic protein solubility (A) and total protein solubility (B) of beef during postmortem aging

溶解度是反映蛋白質聚集和交聯(lián)程度的一個重要指標。如圖4所示，在宰后成熟4 d，高氧氣調包裝牛肉樣品的總蛋白溶解度和肌漿蛋白溶解度與真空包裝牛肉樣品相比無顯著性差異（P＞0.05）。然而，在宰后成熟7 d和10 d，高氧氣調包裝牛肉樣品的總蛋白溶解度和肌漿蛋白溶解度顯著低于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05），可能是宰后成熟后期現(xiàn)變高氧氣調包裝牛肉樣品蛋白質氧化引起蛋白游離巰基結合形成二硫鍵，導致蛋白質最終出性聚集并沉淀[24]。Joo等[12]研究表明，肌漿蛋白溶解度較高的肉其亮度相對較低；Choi等[25]研究表明，總蛋白溶解度較低的肉其亮度較高，這與本研究結果具有一致性。

2.5 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中蛋白氧化程度的影響

圖5 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中肌細胞羰基分布的影響Fig.5 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on protein carbonyl distribution in beef during postmortem aging

通過激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白羰基在肌細胞中的分布能更形象地表征蛋白質氧化程度，且還能看出其動態(tài)變化過程。圖5中白色熒光信號越強，說明蛋白氧化后的羰基含量越高。在宰后排酸24 h（成熟0 d），牛肉部分肌細胞外圍出現(xiàn)較弱的熒光信號。在宰后成熟4 d，高氧氣調包裝的牛肉相對于真空包裝組肌細胞外圍白色熒光信號開始增強，蛋白質氧化程度增加，在宰后成熟7 d，高氧氣調包裝的牛肉相對于真空包裝組肌細胞外圍白色熒光信號增強更加明顯，且分布更均勻。在宰后成熟10 d，高氧氣調包裝的牛肉相對于真空包裝組肌細胞外圍白色熒光信號快速增強，且白色熒光從肌細胞外向肌細胞內(nèi)部進行滲透，真空包裝的牛肉樣品只有肌細胞四周較弱的白色熒光信號。Astruc等[13]的研究結果與本研究類似，其同樣發(fā)現(xiàn)蛋白質氧化從肌細胞外圍的細胞膜氧化開始，隨著時間的延長其氧化開始向肌細胞內(nèi)部滲透，且氧化程度加劇。扶慶權等[26]采用同樣的免疫組化技術對高氧氣調包裝、托盤包裝和真空包裝3 種包裝的牛背最長肌在宰后成熟過程羰基分分布情況時也得到類似的結論，說明高氧氣調包裝的牛肉樣品相對于真空包裝更易發(fā)生蛋白質氧化。

2.6 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中脂肪氧化程度的影響

圖6 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中脂肪氧化的影響Fig.6 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on lipid oxidation in beef during postmortem aging

牛肉的脂肪氧化程度可以用脂肪氧化形成的次級產(chǎn)物含量來評估，即用TBARS值表征[27]。由圖6可知，在宰后成熟過程中，高氧氣調包裝組牛肉樣品的TBARS值均高于真空包裝的牛肉樣品，說明高氧氣調包裝相對于真空包裝不利于抑制鮮肉的脂肪氧化，可能原因是高氧氣調包裝的牛肉樣品因高濃度的氧氣易于氧化脂肪，而真空包裝牛肉樣品因氧氣濃度低而不易氧化。Smiddy等[28]對熟牛肉進行高氧氣調包裝和真空包裝后貯藏，結果發(fā)現(xiàn)高氧氣調包裝的牛肉樣品TBARS值顯著高于真空包裝牛肉樣品。Jongberg等[29]也研究表明，高氧氣調包裝的雞胸肉和雞腿肉在5 ℃貯藏9 d過程中相對真空包裝2-硫代巴比妥酸值顯著增加。

2.7 高氧氣調包裝對牛半膜肌宰后成熟過程中肌鈣蛋白-T降解率的影響

圖7 高氧氣調包裝對宰后牛肉成熟過程中肌鈣蛋白-T降解的影響Fig.7 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on troponin-T proteolysis in beef during postmortem aging

肌鈣蛋白-T的主要功能是和原肌球蛋白結合調節(jié)肌肉的收縮，對鈣離子具有很高的敏感性。鈣蛋白-T還是μ-鈣激活酶進行酶解的底物，在鮮肉宰后成熟過程中會降解產(chǎn)生30 kDa的產(chǎn)物，肌鈣蛋白-T的降解有助于鮮肉嫩度的改善[30-31]。由圖7可知，宰后成熟過程中，高氧氣調包裝的牛肉樣品的肌鈣蛋白-T降解率顯著低于真空包裝的牛肉樣品（P＜0.05），可能是高氧氣調包裝下蛋白質氧化程度高，μ-鈣激活酶的活性受到抑制，從而使得肌鈣蛋白-T的降解率降低[32]。陳琳等[33]的研究結果也發(fā)現(xiàn)了同樣的變化趨勢，其研究發(fā)現(xiàn)高氧氣體包裝的豬肉在宰后成熟6 d肌鈣蛋白-T的降解顯著低于真空包裝組。

3 結 論

與真空包裝相比，高氧氣調包裝在宰后牛肉成熟10 d的整個過程中嫩度及后期肌漿蛋白、總蛋白溶解度顯著降低，脂肪氧化和蛋白質氧化程度加劇，蛋白羰基在肌細胞的分布范圍和密度明顯增加，肌鈣蛋白-T的降解率降低。然而，高氧氣調包裝能較好地保持牛肉顏色的紅度。