食源性致病菌交叉適應(yīng)現(xiàn)象及分子機制的研究進展

陳 欣，胡玲萍，應(yīng)宇斌，劉佳琳，胡亞芹，丁 甜*

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地，浙江省健康食品制造與品質(zhì)控制國際合作基地，浙江 杭州 310058）

在食品生產(chǎn)、加工、貯存和烹飪過程中，食源性致病菌會遭遇一系列對微生物生長和存活產(chǎn)生不利影響的脅迫，包括物理脅迫（高溫、高壓或高滲透壓）、化學(xué)脅迫（酸或消毒劑）、生物脅迫（細(xì)菌素）等[1]。隨著消費者對食物營養(yǎng)和風(fēng)味品質(zhì)要求的提高，現(xiàn)代食品加工的發(fā)展趨勢已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)閹追N較為溫和的加工方式相結(jié)合來取代施加單一的、極端脅迫的方式，其中的典型應(yīng)用為“柵欄技術(shù)”。它通過食品加工過程中多重脅迫耦合的方式對食源性致病菌進行滅活和控制，從而延長食品的保質(zhì)期，確保食品安全[2-4]。但是許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以感受到周圍環(huán)境的變化，并通過改變表型或基因表達來做出適應(yīng)性反應(yīng)[5-6]。除了單一的應(yīng)激反應(yīng)外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)初步暴露于一種給定的應(yīng)激可以為細(xì)菌適應(yīng)另一種應(yīng)激提供有利的條件。這些預(yù)先適應(yīng)亞致死脅迫的細(xì)菌細(xì)胞會做出應(yīng)激反應(yīng)，幫助細(xì)菌修復(fù)自身損傷，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而使細(xì)菌能夠增強對之后遭遇的其他逆境的耐受能力，這種現(xiàn)象稱為交叉適應(yīng)現(xiàn)象[7-9]。

食源性致病菌在食品加工和貯藏中的相關(guān)脅迫誘導(dǎo)下發(fā)生交叉適應(yīng)的現(xiàn)象十分普遍，使細(xì)菌極易在后續(xù)殺菌或抑菌處理中得以存活，從而成為食品安全潛在的風(fēng)險。一些常見的食源性致病菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）等在遭受傳統(tǒng)的脅迫因子如酸、營養(yǎng)限制等條件下，對隨后的高溫脅迫、鹽脅迫、細(xì)菌素等依舊能產(chǎn)生較強的耐受性[10-16]。同時，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，即便是已經(jīng)受到了傳統(tǒng)脅迫處理的食源性致病菌，在面對新型的食品加工技術(shù)時也能產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象（表1）。交叉適應(yīng)現(xiàn)象可以使細(xì)菌在整個食品加工過程中得以生存，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全風(fēng)險。本文綜述了交叉適應(yīng)現(xiàn)象對于致病菌細(xì)胞的影響及其分子機制，總結(jié)常見食源性致病菌的交叉適應(yīng)現(xiàn)象情況，并對于如何減輕交叉適應(yīng)現(xiàn)象進行展望，以期進一步豐富微生物交叉適應(yīng)理論體系，為避免因細(xì)菌耐受性提高而導(dǎo)致的殺菌不徹底現(xiàn)象和進一步優(yōu)化食品加工工藝條件提供理論依據(jù)。

1 常見食源性致病菌的交叉適應(yīng)現(xiàn)象

1.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌

單核細(xì)胞增生李斯特菌是最早被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象的菌株[22]。在肉類和乳制品等食品中，經(jīng)常發(fā)生由李斯特菌污染引起的食品召回和李斯特菌病的暴發(fā)[23-24]。Shen Qian等[25]在肉湯、牛奶和胡蘿卜汁等不同的食品介質(zhì)中研究了酸脅迫適應(yīng)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌在不同溫度下對月桂酸精氨酸的交叉保護作用及其穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)酸脅迫適應(yīng)的細(xì)胞在22 ℃肉湯或4 ℃的牛奶和胡蘿卜汁中存活的菌落濃度比未適應(yīng)的細(xì)胞高約2（lg（CFU/mL））。酸適應(yīng)的交叉保護效應(yīng)也使單核細(xì)胞增生李斯特菌在常用消毒劑如乙醇或季胺化合物中存活的菌落濃度提高了1～3（lg（CFU/mL））[26]。Smith等[27]發(fā)現(xiàn)，預(yù)先受到酸處理的單核細(xì)胞增生李斯特菌提高了在低酸性食品（如白干酪、酸奶、橙汁和色拉醬）中的存活率以及對于非熱滅菌技術(shù)（如輻射、高靜壓技術(shù)）的抵抗力[28-29]。

外界環(huán)境脅迫能增強單核細(xì)胞增生李斯特菌對人體消化道內(nèi)脅迫的耐受性。Begley等[30]將單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞暴露在酸、熱、鹽或十二烷基硫酸鈉的溫和刺激下，這些刺激顯著增強了其耐受人體腸道內(nèi)膽鹽的能力。Ferreira等[31]發(fā)現(xiàn)酸適應(yīng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌在pH值為2.5的胃液培養(yǎng)基中也具有生存能力，說明酸適應(yīng)的細(xì)胞在人體攝入后有機會通過人體胃屏障存活。

1.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是評價食品和加工環(huán)境衛(wèi)生的一個常規(guī)檢測菌種，因為它既存在于相當(dāng)多類型的食品中，如肉類、乳制品、魚類、即食食品等[32-33]，也是人類皮膚和黏膜的共生有機體。食品加工人員可能將攜帶在鼻子或手上的產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌通過人工接觸或呼吸道分泌物等途徑污染食品，這大大增加了金黃色葡萄球菌污染食品的機會[34]。

許多傳統(tǒng)的食品加工貯藏手段均能誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象。Cebrian等[35]發(fā)現(xiàn)酸-熱、酸-H2O2、堿-H2O2、熱-酸和熱-H2O2都可以引起金黃色葡萄球菌交叉適應(yīng)現(xiàn)象的產(chǎn)生。隨后，他們又用酸、堿、H2O2、NaCl、冷熱脅迫對金黃色葡萄球菌進行短期（2 h）預(yù)處理，再使用脈沖電場處理，發(fā)現(xiàn)高溫和堿脅迫聯(lián)合處理下的金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生交叉保護作用[36]。除此之外，在食品加工或生產(chǎn)環(huán)境中很可能由于抗生素的不適當(dāng)使用，而使越來越多金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗藥性，從而誘導(dǎo)交叉適應(yīng)現(xiàn)象的產(chǎn)生。異丙沙星、氯霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、苯唑西林、頭孢西丁和慶大霉素等常見的抗生素能夠提高金黃色葡萄球菌在酸性（pH 1.5）、高溫（63 ℃）和滲透壓（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% NaCl）條件下的存活率[37]。這些耐藥性金黃色葡萄球菌能夠增強對致死性脅迫的耐受能力，提高在食品加工中的殘存機率，對食品安全和消費者的健康造成潛在威脅。

表1 新型食品加工技術(shù)引起的交叉適應(yīng)現(xiàn)象Table 1 Cross-adaptation causes by new food processing technology

1.3 大腸桿菌

大腸桿菌O157:H7通常能夠在一些酸性食物，如酸性水果、發(fā)酵食品中生存[38]。Lee等[39-40]在實驗室培養(yǎng)基和模擬腌制黃瓜體系中添加NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%），相較于沒有添加NaCl的對照組，前一組中受到亞致死性鹽脅迫的大腸桿菌能夠顯著增加其在醋酸體系中的存活率。Ungartti等[41]發(fā)現(xiàn)pH 5.5的非緩沖溶液肉湯中，酸適應(yīng)大腸桿菌O157:H7能提高其耐熱性（58 ℃）。Wambui等[42]研究了不同脅迫對持水牛肉中的大腸桿菌O157:H7熱失活情況的影響，相比于非適應(yīng)對照，冷和干燥脅迫適應(yīng)的細(xì)胞對熱敏感，但酸脅迫適應(yīng)的細(xì)胞能增強其耐熱性。

除此之外，新興抗菌技術(shù)也能誘發(fā)大腸桿菌O157:H7產(chǎn)生交叉保護現(xiàn)象。Aertsen等[43]發(fā)現(xiàn)在50 ℃下熱處理15 min的大腸桿菌細(xì)胞增加了對250 MPa高靜水壓處理的抵抗力。Wang Qingyang等[44]設(shè)計了基于UV-A/UV-C和GA聯(lián)合處理大腸桿菌O157:H7的新抗菌方法，探究預(yù)先暴露于某些亞致死脅迫的大腸桿菌O157:H7對這種新抗菌方法的抵抗力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)先暴露于熱脅迫的大腸桿菌O157:H7對新抗菌方法的抵抗力增加，而預(yù)先暴露于氧化應(yīng)激的細(xì)菌對這種處理方法的敏感性沒有影響，這可能與超氧化物歧化酶等酶的合成增加和一般應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的上調(diào)有關(guān)。

1.4 沙門氏菌

沙門氏菌屬中的常見血清型如鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis），宿主特異性極弱，既可感染動物也可感染人類，常通過動物性食品引起人類中毒[45]。肉類生產(chǎn)加工過程中經(jīng)常采用有機酸對微生物進行消減，如在牛羊肉的屠宰線末端，以有機酸噴淋的形式使胴體菌數(shù)減少[46]，或者在肉制品生產(chǎn)的過程中添加一定比例的鹽來達到抑菌的效果[47]。Karolenko等[48]發(fā)現(xiàn)沙門氏菌暴露于溫和酸刺激條件時可通過酸適應(yīng)來誘導(dǎo)耐熱性，同時提高對鹽脅迫的耐受性。這種酸-熱、酸-鹽的交叉適應(yīng)組合的產(chǎn)生很可能會使滅菌效果大大減弱，從而增加沙門氏菌在食品中的殘留風(fēng)險。沙門氏菌也常存在于蔬菜、水果等生食表面，并且可以在冰箱中存活3～4 個月。Shah等[49]發(fā)現(xiàn)低溫（5 ℃）處理5 h的沙門氏菌能增強對熱的耐受性，從而在隨后施加的酸脅迫（pH 4、90 min）過程中得以存活。

1.5 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）又稱致病性嗜鹽菌，廣泛存在于近岸海水和魚貝類食物中。由副溶血性弧菌引起中毒的食品主要為海產(chǎn)品，以墨魚、蝦、貝類最多見，其次為鹽漬食品和肉類[50]。Chiang等[51]發(fā)現(xiàn)預(yù)先受到酸脅迫（pH 5.5、90 min）的3 株副溶血性弧菌（690、BCRC 13023、BCRC 13025）相較于未處理對照組，對于隨后施加的高溫（47 ℃）、乙醇（體積分?jǐn)?shù)8%）和鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）脅迫具有更強的耐受能力。黃小鳴等[52]用80～250 MPa超高壓處理原始敏感副溶血性弧菌菌株，篩選得到耐高壓菌株，隨后發(fā)現(xiàn)在多種脅迫條件下（如溫度、NaCl、有機溶劑、有機酸）耐高壓副溶血性弧菌菌株均能正常生長。

1.6 志賀氏菌

志賀氏菌（Shigella castellani）是一類革蘭氏陰性短小桿菌，是引起人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌。其中能夠引發(fā)食物中毒的志賀氏菌主要是福氏志賀氏菌，可以通過受到污染的熱肉制品、飲用水等引起人體食物中毒[53]。福氏志賀氏菌在經(jīng)過pH 4.5的鹽酸處理之后，能夠產(chǎn)生明顯的酸適應(yīng)性，同時對它的基因表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)pspE、nanT、clpB、lldp、sitA、cstA基因產(chǎn)生明顯上調(diào)現(xiàn)象，而這些基因都與交叉適應(yīng)現(xiàn)象的產(chǎn)生有關(guān)[54]。當(dāng)志賀氏菌進入人體后，作為具有強耐酸性的腸桿菌，它能夠適應(yīng)腸道內(nèi)的低酸環(huán)境，并抵抗腸道內(nèi)遭遇的其他脅迫（滲透壓、膽鹽）[55]。

2 交叉適應(yīng)現(xiàn)象對食源性致病菌的影響

2.1 對細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞膜是微生物抵御它們所面臨的脅迫環(huán)境條件的第一道屏障。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的組成和物理性質(zhì)，在抵消外界脅迫的不利影響時起著重要的作用。許多研究表明膜流動性和細(xì)菌抗逆性之間存在聯(lián)系[56-58]。目前研究最多的是溫度脅迫對細(xì)菌膜脂肪酸組成和膜流動性的影響。膜流動性降低會使細(xì)菌耐熱性增強，反之亦然[57,59-61]。低溫也能影響細(xì)菌的膜流動性，因此，細(xì)菌可以通過增加其膜中熔點較低的脂肪酸的比例，例如增加不飽和脂肪酸含量來維持膜功能[62]。蠟樣芽孢桿菌即會通過顯著增加不飽和/飽和脂肪酸的比例來適應(yīng)寒冷[63-65]。低溫也能誘導(dǎo)酸適應(yīng)單核細(xì)胞增生李斯特菌的主要的毒力調(diào)節(jié)因子prfA上調(diào)，從而增強其上皮細(xì)胞的侵襲能力和感染秀麗隱桿線蟲（另一種寄主模式系統(tǒng)）的能力[62]。細(xì)菌的酸脅迫耐受能力與細(xì)胞膜的流動性之間也存在關(guān)聯(lián)[66]。Alvarez-Ordó?ez等[57,67]用傅里葉變換紅外光譜監(jiān)測了鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜成分隨酸pH值的變化對細(xì)胞膜流動性的實際影響，發(fā)現(xiàn)暴露在不同種類的脅迫下會導(dǎo)致相當(dāng)大比例的細(xì)胞膜不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為它們的環(huán)狀衍生物，即環(huán)丙烷脂肪。環(huán)丙烷脂肪對細(xì)菌膜變化的貢獻還不完全清楚，但它可能增加了生物膜結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面的穩(wěn)定性，并限制了酰鏈的整體流動性，從而降低了膜的流動性，控制環(huán)境的不良分子滲透進入細(xì)胞[57]。這些膜成分的變化導(dǎo)致細(xì)菌表現(xiàn)出在致死性酸和熱脅迫組合的情況下更高的生存能力。

2.2 對DNA的影響

食源性致病菌經(jīng)食品工業(yè)中常見加工保鮮手段處理后，細(xì)胞內(nèi)的DNA會受到損傷，甚至引起DNA鏈的斷裂，從而抑制其復(fù)制過程。然而在某些非致死性脅迫環(huán)境下，致病菌的DNA雖然受到損傷，但SOS反應(yīng)、DNA保護蛋白（DNA-binding protein，Dps）等應(yīng)激響應(yīng)途徑（詳細(xì)見3.2、3.3節(jié)）也被激活。這些應(yīng)激響應(yīng)途徑能夠起到DNA修復(fù)作用或參與停滯復(fù)制叉的重新啟動，從而增強致病菌對于致死性脅迫的耐受能力[68]。Tandon等[69]發(fā)現(xiàn)一些常用的氧化消毒劑，如H2O2和次氯酸鈉，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞增生李斯特菌的細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的形成，如超氧化物和羥自由基，從而引起DNA損傷。而此時的Dps就可以通過鐵氧化酶活性來保護單核細(xì)胞增生李斯特菌免受氧化逆境。非致命性劑量的UV照射，高溫也會導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌的DNA受損，誘導(dǎo)細(xì)菌出現(xiàn)交叉適應(yīng)現(xiàn)象，對隨后施加的H2O2、酸、乙醇和熱產(chǎn)生耐受性[28,70]。Chatterjee等[71]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA斷裂，復(fù)制分叉停滯，而SOS反應(yīng)能激活recA和SSB基因保護和穩(wěn)定分叉的DNA，為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象提供可能。

2.3 對應(yīng)激基因的影響

食源性致病菌會在多個外界脅迫誘導(dǎo)下，整合相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，通過多個調(diào)控通路來控制應(yīng)激基因的表達，從而做出對外界脅迫的響應(yīng)。Begley等[72]的微陣列實驗揭示了單核細(xì)胞增生李斯特菌對鹽脅迫的適應(yīng)導(dǎo)致opuCA、Betl、bilEAB、bsh的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，這些應(yīng)激基因也幫助提高單核細(xì)胞增生李斯特菌在膽汁中耐受性。He Shoukui等[73]發(fā)現(xiàn)乙醇脅迫會使腸炎沙門氏菌酸休克蛋白基因SEN1564A和rpoS的表達量顯著上調(diào)，有助于提高其在蘋果酸中的存活率。Hamilton等[74]測定了應(yīng)激狀態(tài)下鼠傷寒沙門氏菌生物膜的轉(zhuǎn)錄圖譜，觀察到433 個基因（約占基因組的10%）的表達與浮游狀態(tài)下細(xì)胞相比在生物膜中顯示出2 倍或更大的變化。幾個編碼調(diào)節(jié)全局的基因（如rpoS調(diào)節(jié)子）在應(yīng)激狀態(tài)下的鼠傷寒沙門氏菌的生物膜細(xì)胞中超過25%有上調(diào)現(xiàn)象。這些上調(diào)的基因包括對氧化應(yīng)激（lexA、mrsA、sodA、sodC、gloA）、熱休克（clpA和clpX）、DNA復(fù)制和修復(fù)（recA、mug、pbrB）以及細(xì)胞被膜應(yīng)激（PSPB）作出反應(yīng)的基因。Shah等[75]發(fā)現(xiàn)對數(shù)期培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌對冷脅迫（5 ℃、5 h）的預(yù)適應(yīng)顯著提高了其在隨后酸脅迫（pH 4、90 min）下的存活率?；虮磉_譜顯示，冷脅迫的預(yù)適應(yīng)導(dǎo)致已知在抗酸脅迫中起作用的基因表達上調(diào)，包括與谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和賴氨酸運輸和代謝相關(guān)的多個基因。幾個與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因也表達上調(diào)，這些基因編碼的蛋白質(zhì)被證明可以防止由于酸暴露造成的二次氧化損傷。

2.4 對致病力的影響

致病菌在食品加工過程中受到各種亞致死脅迫（如饑餓、極端溫度、有機酸等）后所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可能會影響細(xì)菌菌株的致病能力。Yoon等[76]發(fā)現(xiàn)預(yù)先暴露于NaCl中的鼠傷寒沙門氏菌增加了對結(jié)直腸腺癌（Caco-2）細(xì)胞的侵襲，也同時增加了其對隨后熱脅迫的抵抗力。在發(fā)生交叉適應(yīng)的過程中，一些應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（如革蘭氏陰性菌中的RpoS、革蘭氏陽性菌中的SigB）通常會參與對應(yīng)食源性病原菌的毒力水平的調(diào)節(jié)，起到協(xié)同轉(zhuǎn)錄的調(diào)控效果，從而增強特定毒力因子表達，有助于致病菌進入宿主體內(nèi)生存[77]。Werbrouck等[78]的研究成果發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞增生李斯特菌能夠在酸脅迫條件下激活SigB，同時也改變了毒力基因inlA的表達水平，并顯著增加了細(xì)菌侵襲Caco-2細(xì)胞的能力。SigB還可以調(diào)節(jié)李斯特菌主要毒力調(diào)節(jié)因子PrfA的轉(zhuǎn)錄，還有幾個毒力基因能夠同時受PrfA和SigB的共同調(diào)控，包括編碼內(nèi)素和膽鹽水解酶的基因[79]。Foster等[80]發(fā)現(xiàn)低pH值和高溫等幾種環(huán)境條件能誘導(dǎo)沙門氏菌的Rpos應(yīng)激因子進行響應(yīng)，Rpos能夠調(diào)節(jié)質(zhì)粒毒力基因（SPV），促使SPV毒力蛋白的表達，這些耐熱和耐酸的腸炎沙門氏菌PT4細(xì)胞對小鼠和雞的毒力和侵襲力均較強[81]。此外，某些特定的應(yīng)激基因/因子也可能會影響食源性致病菌的毒力。編碼滲透壓轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的opuC突變使單核細(xì)胞增生李斯特菌對鹽脅迫更加敏感，并顯著降低了該細(xì)菌在老鼠小腸上部的定殖能力[2]。金黃色葡萄球菌的PerR因子作為特定的H2O2感受器，所調(diào)節(jié)的基因可以將金黃色葡萄球菌對氧化脅迫的抗逆性和致病性聯(lián)系起來形成復(fù)雜的共同調(diào)節(jié)過程，增強其在粒細(xì)胞內(nèi)存活的能力[82]。

3 食源性致病菌產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象的分子機制

3.1 σ因子

感知和應(yīng)對環(huán)境變化的能力對于致病菌的生存至關(guān)重要。當(dāng)致病菌受到亞致死脅迫的時候，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的應(yīng)激基因很可能與隨后施加的致死性脅迫所產(chǎn)生的應(yīng)激基因存在高度重疊。因此，一旦外界脅迫條件改變，致病菌就可以直接抵抗隨后施加的致死性脅迫，而不需要重新產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激基因。其中起到總調(diào)控作用的是σ因子。它是RNA聚合酶全酶的可分離亞基，能將細(xì)菌RNA聚合酶引導(dǎo)至位于轉(zhuǎn)錄起始點上游10 個和35 個堿基對的特定啟動子元件上，促使啟動子識別和轉(zhuǎn)錄啟動，產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激調(diào)控機制[83-84]。

σ因子根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，可分為4 個不同的組（σ1～4）：負(fù)責(zé)大多數(shù)基因在有利條件下表達的管家σ因子（σ1）以及結(jié)構(gòu)上相關(guān)的可變σ因子（σ2～4）。盡管大多數(shù)細(xì)菌都含有管家σ因子，可變σ因子在不同的致病菌生物體中數(shù)量差異很大[85]?？勺儲乙蜃油ǔＷ饔糜趩犹囟ǖ幕蚪M以響應(yīng)適當(dāng)?shù)男盘?。它們的功能可以分? 類：應(yīng)激響應(yīng)、發(fā)育和輔助新陳代謝。其中，應(yīng)激響應(yīng)功能可以通過對總調(diào)控可變σ因子（σ2）和胞外功能σ因子（extracytoplasmic function Sigma factors，ECF σ factors）（σ4）進行調(diào)控。它們引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合到不同的啟動子位點，調(diào)節(jié)基因子集的表達，其表達產(chǎn)物能促進致病菌表型或基因型改變，從而適應(yīng)外界脅迫因素的變化[86]。應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)調(diào)控因子及其功能見表2。

表2 應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)調(diào)控因子及其功能Table 2 Stress-related regulatory factors and their functions

3.1.1 總調(diào)控可變σ因子

總調(diào)控可變σ因子在革蘭氏陽性菌中的存在形式為RpoS（σS），革蘭氏陰性菌中為SigB（σB）。Nelson[95]和Ait-Ouazzou[96]等通過構(gòu)建大腸桿菌rpoS基因缺失菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌sigB基因缺失菌來比較它們在施加了亞致死條件之后對致死性條件的耐受能力。rpoS和sigB缺失菌株相較于完整菌株在預(yù)先受到精油抑菌或酸處理再接受脈沖電場或者熱處理之后，它的細(xì)菌數(shù)量減少程度遠(yuǎn)高于完整菌株。這說明RpoS和SigB這兩種Sigma因子能夠增強細(xì)菌對于之后的致死性脅迫的應(yīng)激能力。

由rpoS編碼的總調(diào)控可變σ因子RpoS能在多種應(yīng)激條件下對革蘭氏陰性菌起到保護作用。Hengge-Aronis等[97]發(fā)現(xiàn)RpoS在穩(wěn)定期大腸桿菌中控制240多個基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因編碼脅迫管理蛋白、代謝酶、膜蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，對隨后受到各種脅迫條件，如饑餓、高滲透壓、pH值降低、高溫或低溫起到調(diào)控作用。也能通過RpoS的調(diào)控提高鼠傷寒沙門氏菌在酸、氧化應(yīng)激、熱、滲透壓等脅迫條件下的存活率[98]。類似地，另一種由sigB編碼的SigB因子在革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌、李斯特菌等中起到調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的作用。枯草芽孢桿菌中已經(jīng)鑒定出至少100 種依賴于SigB的應(yīng)激蛋白，它們對各種環(huán)境脅迫具有保護作用[99-100]。Hain等[101]發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌的SigB因子能通過脅迫條件（鹽、乙醇、有機酸、熱休克）激活，誘導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，其中包括編碼溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞壁蛋白、通用應(yīng)激蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因，以及參與滲透調(diào)節(jié)、碳代謝、核糖體和包膜功能的基因，從而觸發(fā)保護性響應(yīng)。

3.1.2 ECF σ因子

ECF σ因子存在于細(xì)胞膜上，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的相關(guān)過程，如分泌、胞外多糖的合成、鐵離子的輸入或排出、胞外蛋白酶的合成等。在沒有逆境脅迫的情況下，它通過抗σ因子（ECF活性的負(fù)面操縱子）抑制而保持非活性。當(dāng)細(xì)胞外產(chǎn)生逆境，會引發(fā)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，通過信號感應(yīng)和傳導(dǎo)使相應(yīng)的抗σ因子蛋白水解或構(gòu)象變化失活，從而導(dǎo)致ECF σ因子的釋放。釋放后的ECF σ因子可自由結(jié)合至DNA，并指導(dǎo)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄特定應(yīng)激響應(yīng)基因[102-104]（圖1）。

圖1 ECF σ因子應(yīng)激響應(yīng)過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of response of extracytoplasmic function Sigma factors to stress

大腸桿菌中的RpoE（σE）是最早被發(fā)現(xiàn)的ECF σ因子，其也是革蘭氏陰性菌中最常見的ECF因子，其活性是由外膜錯誤折疊的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的[105]。因此，RpoE調(diào)節(jié)子含有折疊酶、蛋白酶、脂多糖生物合成蛋白和伴侶蛋白的基因[106]。這些基因是維持細(xì)胞膜完整性所必需的，而細(xì)胞膜完整性可以幫助致病菌更好地應(yīng)對外界脅迫誘導(dǎo)的損傷。而革蘭氏陽性菌中的ECF因子種類、數(shù)量相差很大，除了通過維持細(xì)胞膜完整性以應(yīng)對脅迫，特定脅迫需要相對應(yīng)的特殊ECF因子來進行應(yīng)激調(diào)控。例如苦草芽孢桿菌對溶菌酶的抗性需要通過σV誘導(dǎo)dltABCDE和oatA的表達而產(chǎn)生[107]。此外，ECF σ因子在革蘭氏陽性菌或陰性菌中都存在冗余現(xiàn)象，這樣的冗余現(xiàn)象可以在交叉適應(yīng)現(xiàn)象中起到一定的作用?？莶輻U菌中σM、σW和σX的重疊調(diào)控在面對不同的抗菌化合物引起相似類型的損傷時，只需要啟動一套共同的防御措施[108]。ECF σ因子AlgU/T能刺激銅綠假單胞菌生成黏液表型，使其增強對多種抗菌劑的耐藥性，也能對隨后由抗菌劑引起的氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護作用[109]。

3.2 雙組分系統(tǒng)

雙組分系統(tǒng)（two-component systems，TCS）是致病菌感知外界脅迫信號，將信號分子傳導(dǎo)至菌體內(nèi)部，從而激發(fā)相應(yīng)調(diào)控機制的重要途徑。在交叉適應(yīng)中，一個TCS感知到多種應(yīng)激信號后，可以通過立體的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)進行信號放大，再通過激活其他TCS和/或σ因子等體系間接達到調(diào)控效果[110]。

TCS由兩部分組成，一部分是用于脅迫感應(yīng)的膜結(jié)合組氨酸激酶，另一部分是用于調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)調(diào)控因子[111]。通常對于脅迫信號的檢測和傳導(dǎo)如下：檢測到特定信號后組氨酸激酶發(fā)生自磷酸化，從而使組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移（histidine-phosphotransfer，DHp）域中的保守組氨酸殘基磷酸化，該殘基磷酸轉(zhuǎn)移至同源反應(yīng)調(diào)控因子的接受（receiver，REC）域上與天冬氨酸殘基結(jié)合。反應(yīng)調(diào)控因子的磷酸化誘導(dǎo)其構(gòu)象改變，從而調(diào)節(jié)其活性，并啟動應(yīng)激響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[112]（圖2[113]）。但革蘭氏陰性菌的某些特定的TCS響應(yīng)機制會有所不同，通過激活另一系統(tǒng)或蛋白啟動應(yīng)激響應(yīng)。PhoP/PhoQ系統(tǒng)在響應(yīng)環(huán)境中的H＋信號后，能夠激活RstA/RstB系統(tǒng)，進而促進Fe2＋轉(zhuǎn)運蛋白的生成和細(xì)胞對Fe2＋的攝取，可見RstA/RstB和PhoP/PhoQ系統(tǒng)能幫助細(xì)菌應(yīng)對酸性環(huán)境下Fe2＋脅迫。EnvZ/OmpR系統(tǒng)作為滲透脅迫相關(guān)的TCS，當(dāng)滲透壓發(fā)生變化時，磷酸化的OmpR能夠調(diào)節(jié)OmpF和OmpC兩種孔道蛋白的表達，OmpC和OmpF在外膜上形成一個通道，能夠允許小分子質(zhì)量的親水性物質(zhì)通過被動運輸擴散進到膜內(nèi)[114]。

TCS除了可以用來應(yīng)對外界環(huán)境的變化，也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞毒力情況。革蘭氏陰性菌常見的PhoP/PhoQ、OmpR/EnvZ、PmrA/PmrB、EvgS/EvgA等TCS除了與誘導(dǎo)菌株抵抗酸、抗菌肽、高鹽脅迫的能力有關(guān)之外，還可以參與細(xì)胞Mg2＋和毒力的調(diào)控[115-118]。革蘭氏陽性菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌的VirS/VirR系統(tǒng)和金黃色葡萄球菌雙組分系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子AgrA也能調(diào)控細(xì)菌毒力因子的表達[119-120]。

圖2 TCS對脅迫信號的傳導(dǎo)示意圖[113]Fig.2 Schematic diagram of the transduction of stress signal by two-component systems[113]

3.3 SOS反應(yīng)

當(dāng)致病菌受到亞致死脅迫之后，通常會引起DNA損傷或復(fù)制叉坍塌導(dǎo)致ssDNA暴露，這時就會引發(fā)SOS反應(yīng)[121]。SOS反應(yīng)是通過誘導(dǎo)一系列能夠處理DNA損傷的基因表達，從而對損傷的DNA進行修復(fù)的整體應(yīng)答機制。在不同的革蘭氏陽性菌或陰性菌中，SOS反應(yīng)所誘導(dǎo)的調(diào)控基因種類相差較大。Kelley[122]對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌SOS調(diào)控子的比較分析顯示，重疊之處僅有8 個基因，而這兩個物種的SOS調(diào)控子都包含30 多個基因。SOS反應(yīng)過程通常都受LexA和recA基因產(chǎn)物的調(diào)控，LexA是一種SOS轉(zhuǎn)錄阻遏物，在發(fā)生SOS反應(yīng)之前與SOS調(diào)控基因的操縱子位點結(jié)合。RecA可以檢測到DNA損傷的存在，并且非特異性地與單鏈DNA結(jié)合并導(dǎo)致LexA的自動催化裂解，隨后使SOS反應(yīng)調(diào)控基因的表達不再受到抑制，誘導(dǎo)一系列處理DNA損傷及其在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的基因的程序性表達[123-125]。

食品加工過程中，常使用各種依賴于致病菌DNA損傷的表面處理或清潔劑，如UV或氧化劑。而這些非致死劑量的UV或氧化劑處理，可能導(dǎo)致致病菌出現(xiàn)交叉適應(yīng)現(xiàn)象，從而增加其在消毒處理期間的存活機會[126-128]。預(yù)先暴露于UV的乳酸乳球菌能對酸（pH 4.0）、乙醇（20%，V/V）、H2O2（15 mmol）或高溫（52 ℃）產(chǎn)生交叉保護作用，隨后再用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳比較UV（100 J/m2）處理和未處理培養(yǎng)物的全細(xì)胞蛋白提取液，發(fā)現(xiàn)UV處理后，至少誘導(dǎo)了14 種多肽對損傷作出反應(yīng)。在這個交叉適應(yīng)過程中，致病菌的SOS反應(yīng)受到激活。Chen Jun等[129]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激適應(yīng)的熒光假單胞菌SN15-2在隨后的高溫條件下死亡率顯著低于對照組，表明氧化應(yīng)激適應(yīng)可以提高它們的耐熱性，而其中參與脅迫防御反應(yīng)的差異表達蛋白質(zhì)是由SOS反應(yīng)引起的。因此，在多種應(yīng)激誘導(dǎo)DNA損傷（UV、氧化應(yīng)激）或復(fù)制叉失速（熱應(yīng)激）中，SOS反應(yīng)能激活一系列保護和穩(wěn)定分叉的基因（如recA和SSB）以及通過核苷酸切除或重組修復(fù)機制來處理有害損傷的基因（如uvrA、uvrB、ydjQ、UvrD、recN和ruvAB），這對于致病菌在食品加工環(huán)境中保存壓力和消毒處理的生存起到重要作用[130-132]。

3.4 DNA保護蛋白

饑餓細(xì)胞的Dps作為一種新的DNA結(jié)合蛋白，最早由Almron發(fā)現(xiàn)它能在大腸桿菌細(xì)胞遭受饑餓脅迫時起到調(diào)節(jié)和保護作用[133]。隨后，有許多研究發(fā)現(xiàn)Dps在許多細(xì)菌細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的外界環(huán)境脅迫時，能夠為其提供保護。它提供多方面保護的能力是基于兩個固有屬性：DNA結(jié)合能力和鐵氧化酶活性。這也使得Dps在致病菌受到酸和堿沖擊、鐵和銅毒性、高鹽或輻射誘導(dǎo)的應(yīng)激條件方面起到重要作用[134-135]。

當(dāng)致病菌受到亞致死脅迫之后，它的DNA大分子會受到一定程度的損傷，這時候Dps就會在自我聚集的同時和DNA共同結(jié)晶形成Dps-DNA復(fù)合體。Wang Binbin等[136]用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測了6 種代表性Dps：DprA、SsbA、RadA、RadC、RecA和RecQ在乳酸乳球菌中先受到紅霉素再受到酸脅迫時的表達情況。結(jié)果顯示，在乳酸乳球菌出現(xiàn)交叉適應(yīng)現(xiàn)象時，這幾種Dps均出現(xiàn)了表達上調(diào)的情況。說明Dps在其中發(fā)揮了與外源單鏈DNA結(jié)合以維持其穩(wěn)定性的作用，同時在強酸脅迫條件下，Dps也能保護暴露的細(xì)胞免受DNA鏈斷裂而死亡。但當(dāng)致病菌受到某些外界脅迫變化（鐵限制、氧化脅迫）時，由于不同的防御蛋白的表達，在不同的物種中可能會遇到不同的情況。某些細(xì)菌（如李斯特菌）僅含有Dps蛋白，因此在Dps蛋白的鐵氧化酶位點，每還原一個H2O2分子就有兩個亞鐵離子被氧化，從而避免了通過Fenton反應(yīng)形成羥自由基，保護細(xì)菌免受H2O2損傷[137]。而有些細(xì)菌（如大腸桿菌、長柄芽孢桿菌、炭疽桿菌和根癌桿菌），除了含有Dps蛋白，還有鐵蛋白等其他防御蛋白。鐵蛋白能夠在鐵限制條件下發(fā)揮儲存鐵的重要作用，也能夠輔助Dps蛋白產(chǎn)生H2O2脅迫抗性[138]。

4 結(jié) 語

隨著食品產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展和食品的快速流通，食源性致病菌在食品加工和貯藏相關(guān)脅迫誘導(dǎo)下發(fā)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象，從而引起表型或基因型的改變，在整個食品加工過程中得以生存，留下嚴(yán)重的食品安全隱患。目前，關(guān)于食源性致病菌產(chǎn)生交叉適應(yīng)現(xiàn)象的分子機制研究主要圍繞σ因子、TCS、SOS反應(yīng)和DNA結(jié)合蛋白的性質(zhì)和調(diào)控機制進行展開，但是在某些特定脅迫組合下對于致病菌存活的具體調(diào)控機制和不同系統(tǒng)之間的協(xié)同作用仍不明確。因此，需要進一步研究各種致病菌在多種復(fù)合環(huán)境脅迫下的亞致死情況和應(yīng)激反應(yīng)機制，從而達到更高效的滅菌目的。在避免/減輕交叉適應(yīng)情況方面，食品加工領(lǐng)域需要盡量避免這些能夠引起交叉適應(yīng)現(xiàn)象的脅迫組合。在未來的研究中，可以對脅迫誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、蛋白酶等在轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)或活性水平上進行量化，使它們成為菌株抗逆性的重要生物標(biāo)志物，從而幫助識別細(xì)菌短期和長期耐受性反應(yīng)。這種在分子和表型水平上定量關(guān)聯(lián)微生物的反應(yīng)可以幫助識別致病菌在脅迫條件和特定食品貯藏加工手段下的表型行為，有助于設(shè)計和開發(fā)更有效的食品保存方法或控制策略[77]。