核酸-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物的研究進(jìn)展

辛 亮，張?zhí)m威*

（1.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100084；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

食品病原微生物是威脅人類健康的重大問題。美國(guó)疾病控制中心數(shù)據(jù)顯示，每年病原微生物污染的食品導(dǎo)致約4 800萬 人患病，128 000 人住院，僅在美國(guó)每年就有3 000 人死亡[1-2]。引起食源性疾病爆發(fā)的主要病原微生物為Salmonellaspp.、Escherichia coliO157:H7、Listeria monocytogenes、Clostridium perfringens、Norovirus、Hepatitis A、Cryptosporidium、Cyclospora和Toxoplasma，這些病原微生物可以通過空氣、水和土壤等傳播，在食品加工、運(yùn)輸和貯存等階段污染食品[3-5]。

傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)采用平板培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定的方法[6]。雖然該方法成本低廉，但是操作繁瑣、耗時(shí)久，檢測(cè)速度受到微生物在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力的限制，通常需要2～3 d進(jìn)行初步鑒定，一周以上才能確認(rèn)微生物種類[7]；由于存在不可培養(yǎng)微生物，傳統(tǒng)檢測(cè)方法會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，增加了病原微生物的傳播風(fēng)險(xiǎn)[8]。基于核酸檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增樣品中低水平目標(biāo)微生物的核酸，這是研究人員將研究轉(zhuǎn)向基于核酸檢測(cè)方法的主要原因[9]。在過去的幾十年里，核酸檢測(cè)方法廣泛發(fā)展，但由于食物成分復(fù)雜，往往需要樣品前處理以及昂貴的設(shè)備和有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)操作人員，現(xiàn)場(chǎng)和普通工業(yè)實(shí)驗(yàn)室無法達(dá)到檢測(cè)要求[10]。近年來，微流控系統(tǒng)的出現(xiàn)為食品病原微生物的高效檢測(cè)提供了強(qiáng)大技術(shù)基礎(chǔ)。2006年，Whitesides定義了微流控技術(shù)，它是指利用微米級(jí)通道精確地操控微量流體[11]。微流控芯片體積小，試劑和樣品消耗少，而且便于攜帶，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12]；微流控芯片的比表面積高，傳質(zhì)和傳熱速率快，可有效縮短檢測(cè)時(shí)間；而且微流控芯片設(shè)計(jì)靈活，可將多個(gè)實(shí)驗(yàn)集成至單個(gè)微流控芯片，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，極大提高檢測(cè)效率的同時(shí)，避免樣品在檢測(cè)過程中出現(xiàn)交叉污染[13]。

目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinant polymerase amplification，RPA）、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和解旋酶依賴擴(kuò)增（helicase dependent amplification，HDA）等方法均已結(jié)合微流控芯片應(yīng)用于食品病原微生物的檢測(cè)。微流控芯片與核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合為從復(fù)雜的食物基質(zhì)中簡(jiǎn)便高效地檢測(cè)病原微生物提供了新的可能。本文對(duì)近年來核酸擴(kuò)增結(jié)合微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物的相關(guān)技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 PCR-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

PCR技術(shù)的發(fā)展在分子生物學(xué)上引起了一場(chǎng)革命，它使DNA分子的擴(kuò)增可在短時(shí)間內(nèi)跨越多個(gè)數(shù)量級(jí)[14]。PCR反應(yīng)通常包括3 個(gè)步驟：變性、退火和延伸。在變性（≈95 ℃）步驟中，雙鏈DNA變成兩條單鏈，經(jīng)退火（≈56 ℃）步驟降低溫度，使引物與單鏈DNA模板結(jié)合；在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料進(jìn)行延伸，合成一條與模板鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，如此循環(huán)獲得大量目標(biāo)基因；為保證聚合酶活性，延伸溫度通常設(shè)置為72 ℃左右[15]。自1998年P(guān)CR技術(shù)首次與微流控芯片結(jié)合應(yīng)用以來，越來越多的研究人員深入發(fā)展PCR-微流控芯片[16]。PCR-微流控芯片檢測(cè)利用微流控器件熱質(zhì)量小和比表面積高的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)快速傳熱，從而縮短PCR擴(kuò)增過程中穩(wěn)定溫度所需的時(shí)間。與傳統(tǒng)PCR相比，PCR-微流控芯片可以獲得更均勻的體系溫度，有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)量，使檢測(cè)更靈敏。

PCR-微流控芯片逐漸成為食源性致病菌檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。Salman等建立了一種分流PCR方法，采用并聯(lián)熱循環(huán)器使微流控芯片的反應(yīng)室在不同的溫度區(qū)域之間移動(dòng)，反應(yīng)體系于期望溫度處停留相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，完成PCR過程。反應(yīng)裝置中的3 塊加熱板取代了價(jià)格昂貴且笨重的PCR儀[17]。該體系對(duì)于E.coli的檢測(cè)限（limit of detection，LOD）低至0.7 ng/μL，且所用設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，具有極強(qiáng)的可應(yīng)用性。

提高微生物DNA提取效率可有效提高PCR-微流控芯片的檢測(cè)靈敏度。Zhang Huilin等設(shè)計(jì)同軸通道的DNA提取微流控芯片[18]。首先，將磁性玻璃珠泵入同軸通道，通過施加多環(huán)高梯度磁場(chǎng)使其在通道中均勻分布。然后將E.coliO157:H7裂解，釋放胞內(nèi)物質(zhì)于同軸通道，磁性玻璃珠高效提取其中的DNA，提取量較之前的空心毛細(xì)管通道提高了4 倍左右，LOD低至12 CFU/mL，該方法具有檢測(cè)較低水平E.coliO157:H7的能力[18]。

食品病原微生物的檢測(cè)經(jīng)常需要多個(gè)目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，不同引物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)和抑制影響液相PCR的檢測(cè)效果。研究人員嘗試將多對(duì)引物固定于支持物上，以類似于原位PCR的方式一次性對(duì)樣品中的多個(gè)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，避免了引物種類過多帶來的干擾，這種方法稱為固相PCR（solid phase PCR，SP-PCR）[19]。Hung等基于超臨界角熒光（super critical angle fluorescence，SAF）原理設(shè)計(jì)微透鏡陣列微流控芯片，并將SP-PCR引物嵌入陣列中，實(shí)現(xiàn)了4 種目的基因同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)，并且SAF設(shè)計(jì)可將LOD優(yōu)化至1.6 拷貝數(shù)/μL，為微流控芯片檢測(cè)提供了新的研究方向[20]。

PCR-微流控芯片的檢測(cè)方法仍然存在一定問題，例如連續(xù)單向流動(dòng)PCR體系容易被微流控芯片通道表面吸附，通道中心與接近表面區(qū)域的流速不同造成熱循環(huán)中PCR反應(yīng)體系的停留時(shí)間存在誤差等。這些問題一定程度上限制了PCR-微流控芯片檢測(cè)的應(yīng)用[21]。

2 等溫?cái)U(kuò)增-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)解決了PCR變溫過程帶來的弊端，其體系在等溫條件下擴(kuò)增效率良好，所需能量減少，儀器要求降低。將等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與微流控芯片結(jié)合可以開發(fā)更簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)平臺(tái)，使非專業(yè)技術(shù)人員能夠在實(shí)驗(yàn)室外進(jìn)行操作[22]。近十年，多種等溫?cái)U(kuò)增方法已與微流控芯片結(jié)合應(yīng)用于食品病原微生物的檢測(cè)中。

2.1 LAMP-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

LAMP由Notomi等于2000年建立，是近年來應(yīng)用最廣泛的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[23]。LAMP的基本原理是設(shè)計(jì)2～3 套引物，60～65 ℃恒溫條件下，利用BstDNA聚合酶的高鏈置換活性和復(fù)制活性介導(dǎo)DNA鏈的循環(huán)置換合成，30～60 min內(nèi)即可得到目的基因的106～109拷貝數(shù)[24]。

離心式微流控芯片是微流控檢測(cè)領(lǐng)域近年的創(chuàng)新熱點(diǎn)。離心式微流控芯片呈光碟形狀，上置多個(gè)反應(yīng)單元。反應(yīng)起始、試劑混合、儲(chǔ)存和計(jì)量等均由圓盤的旋轉(zhuǎn)控制。因其設(shè)計(jì)靈活、操作簡(jiǎn)單且通用性強(qiáng)得到廣泛應(yīng)用[25]。Nguyen等將LAMP與微流控芯片結(jié)合，建立了一種便攜離心檢測(cè)裝置。首先，將樣品加入芯片，然后利用離心力將儲(chǔ)存于芯片試劑盒中的試劑釋放至指定區(qū)域與樣品混合，發(fā)生LAMP反應(yīng)（圖1[26]）。反應(yīng)結(jié)束后，通過比色法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。該裝置可在1 h內(nèi)完成對(duì)E.coliO157:H7、Salmonella typhimurium和Vibrio parahaemolyticus的檢測(cè)，LOD均為102個(gè)/mL[26]。另有研究將生物素-鏈霉親和素試紙條與離心式LAMP-微流控芯片結(jié)合，用于判定檢測(cè)終點(diǎn)，無需儀器或人工干預(yù)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程。該系統(tǒng)用于乳中S.typhimurium和V.parahaemolyticus的多重檢測(cè)，反應(yīng)80 min的LOD可達(dá)50 CFU[27]。LAMP-微流控芯片通常需要其他設(shè)備輔助調(diào)控反應(yīng)溫度，存在一定誤差，影響檢測(cè)效率，芯片的精確測(cè)溫和加熱系統(tǒng)設(shè)計(jì)仍存在很大挑戰(zhàn)。Lim等提出了一種基于離心式微流控芯片的自動(dòng)回路LAMP檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用熱變色涂層遠(yuǎn)距離測(cè)量腔體內(nèi)部溫度，并在腔體內(nèi)覆蓋一層微石墨膜，超高速遠(yuǎn)程吸收激光束，實(shí)現(xiàn)無物理接觸的溫度測(cè)量和加熱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠有效地實(shí)現(xiàn)LAMP檢測(cè)，靈敏度仍需進(jìn)一步提高[28]。

近年來智能手機(jī)應(yīng)用普遍，無線通信技術(shù)快速發(fā)展。智能手機(jī)中包埋若干感應(yīng)器，例如攝像頭和音頻插口。智能手機(jī)和微流控芯片均具有易操作和便攜帶的特點(diǎn)，基于微流控芯片和智能手機(jī)傳感器可以開發(fā)一系列應(yīng)用程序，支持實(shí)驗(yàn)室外的食品病原微生物檢測(cè)[29]。Sayad等設(shè)計(jì)離心式LAMP芯片，自動(dòng)完成LAMP反應(yīng)后，采用鈣黃綠素比色法判定檢測(cè)終點(diǎn)。紫外線發(fā)射器（365 nm）激發(fā)鈣黃綠素，光學(xué)傳感器識(shí)別發(fā)射光并導(dǎo)入電機(jī)，通過無線藍(lán)牙電子系統(tǒng)將信號(hào)傳輸?shù)街悄苁謾C(jī)，完成檢測(cè)結(jié)果的輸出。將該方法用于雞肉中E.coli、Salmonellaspp.和Vibrio cholerae的檢測(cè)，60 min的LOD為3×10-5ng/μL DNA[30]。智能手機(jī)與微流控芯片的結(jié)合提供了強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)，以移動(dòng)方式實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端的數(shù)據(jù)分析和管理。

離心力可以使離心式微流控芯片中的LAMP反應(yīng)體系自動(dòng)配置，濾紙的毛細(xì)效應(yīng)也有相應(yīng)功能。Pang Bo等設(shè)計(jì)了聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）/紙芯片用于LAMP檢測(cè)，該芯片由3 層組成，分別為中央進(jìn)液層、反應(yīng)層和支撐層，其中，浸有LAMP引物的濾紙片位于支持層和反應(yīng)層之間（圖2[31]）。當(dāng)LAMP其余反應(yīng)成分和樣品注入芯片后，濾紙片將其吸入并與引物混合，開始LAMP反應(yīng)，反應(yīng)終點(diǎn)由羥基萘酚藍(lán)和SYBR Green I染料判定。該芯片多重檢測(cè)蝦肉中Staphylococcus aureus和V.parahaemolyticus結(jié)果的LOD為103CFU/mL[31]。雖然此方法的LOD并不理想，但是裝置的制作無需精密光刻且反應(yīng)過程無需離心裝置，具有應(yīng)用于資源匱乏地區(qū)的潛力。

LAMP-微流控芯片檢測(cè)所用試劑價(jià)格低、靈敏度高、特異性強(qiáng)，反應(yīng)過程中無需熱循環(huán)。而且LAMP對(duì)模板要求低于PCR，可以在復(fù)雜的生物基質(zhì)中進(jìn)行，因此，LAMP-微流控芯片具有現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)；LAMP-微流控芯片檢測(cè)也存在一些問題，例如檢測(cè)需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，較為復(fù)雜，對(duì)于未知序列的目標(biāo)基因無法檢測(cè)等[32]。

2.2 RPA-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

RPA是一種等溫?cái)U(kuò)增方法，自2006年發(fā)表以來，引起了研究人員的重點(diǎn)關(guān)注。RPA反應(yīng)的第一步是引物與E.coliRecA重組酶結(jié)合形成復(fù)合體，當(dāng)復(fù)合體搜索到模板中存在的引物互補(bǔ)序列后，重組酶打開雙鏈DNA，引物與同源序列發(fā)生鏈置換，形成D-loop復(fù)合物，單鏈核酸結(jié)合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）隨即與互補(bǔ)鏈結(jié)合，穩(wěn)定引物。重組酶解離后，DNA聚合酶識(shí)別引物3’端并啟動(dòng)DNA擴(kuò)增反應(yīng)，新生成的DNA鏈可作為下一輪RPA的模板[33]。RPA操作溫度為37～40 ℃，反應(yīng)效率高，獲得104拷貝數(shù)僅需10 min左右[34]。

Lutz等于2010年首次提出RPA-微流控芯片檢測(cè)雙鏈DNA的方法，并以mecA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析了該方法檢測(cè)S.aureus的可行性[35]。目前，已有研究將RPA檢測(cè)食品病原微生物的全過程集成于單個(gè)微流控芯片。Kim等開發(fā)了一種用于食品中Salmonella enteritidis檢測(cè)的離心式微流控芯片。首先，利用免疫磁珠對(duì)樣品中的少量檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行富集，然后激光二極管驅(qū)動(dòng)閥門打開使樣品進(jìn)入反應(yīng)室，再由激光調(diào)節(jié)溫度開始反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，通過離心力將樣品送入稀釋室，最后通過反應(yīng)體系與橫向流動(dòng)試紙條反應(yīng)表征檢測(cè)結(jié)果。將該裝置用于乳中S.enteritidis的檢測(cè)僅需不到30 min，LOD為102CFU/mL[36]。Kunze等也建立了一種RPA-微流控芯片的集成檢測(cè)方法，該方法中設(shè)計(jì)了微陣列芯片，結(jié)合化學(xué)發(fā)光法分析檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)用于Enterococcus faecalis的檢測(cè)，48 min的LOD為5×103基因組/μL[37]。

滑動(dòng)芯片自2009年創(chuàng)建以來，以其操作簡(jiǎn)單、無需泵或閥門輸送液體的特點(diǎn)備受關(guān)注。滑動(dòng)芯片由頂板和底板組成，兩塊板放在一起并相對(duì)滑動(dòng)使試劑在重疊部分進(jìn)行交換并發(fā)生反應(yīng)[38]。頂板和底板組合后共有6 個(gè)重復(fù)反應(yīng)孔和2 個(gè)陰性對(duì)照孔，對(duì)照孔中一個(gè)無DNA，一個(gè)無乙酸鎂；縱向側(cè)視圖中演示加載配置。用移液槍將DNA樣本、RPA體系和乙酸鎂分別裝入樣本孔中；側(cè)視圖顯示了設(shè)備的尺寸和特征。Tsaloglou等將RPA與滑動(dòng)芯片結(jié)合（圖3[39]），以tacB為靶基因，實(shí)時(shí)檢測(cè)Clostridium difficile的LOD為103DNA 拷貝數(shù)，用時(shí)不到20 min[39]。

圖3 滑動(dòng)芯片示意圖[39]Fig.3 Schematic illustration of the slip chip[39]

RPA-微流控檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，對(duì)樣本純度要求較低，無需DNA初始加熱變性步驟。但是，RPA的引物長(zhǎng)度通常大于30 bp，有一定合成難度且體系較難優(yōu)化。

2.3 NASBA-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

NASBA由Compton于1991年發(fā)明，該技術(shù)是以RNA為模板的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[40]。NASBA體系中包括兩條根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)設(shè)計(jì)的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）、RNase H和T7 RNA聚合酶。NASBA反應(yīng)過程中，第一條引物的5’端與T7 RNA聚合酶連接并與模板中的互補(bǔ)位置結(jié)合，引導(dǎo)RT合成RNA模板的互補(bǔ)DNA鏈；然后，RNase H破壞RNA模板，第二條引物結(jié)合在（反義）DNA鏈的5’端，RT再次延伸引物合成另一條DNA鏈，產(chǎn)生雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶以DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的RNA拷貝，每個(gè)新合成的RNA都是下一個(gè)循環(huán)階段的模板，RNA指數(shù)擴(kuò)增。NASBA于41 ℃反應(yīng)1.5 h可以產(chǎn)生約1010的目標(biāo)RNA[41]。

NASBA可將mRNA、rRNA、tmRNA、SSDNA和病毒的核酸作為檢測(cè)目標(biāo)。其中，由ssrA編碼的tmRNA較為穩(wěn)定，接近DNA的魯棒性，是很好的檢測(cè)目標(biāo)。Dimov等將tmRNA純化和NASBA檢測(cè)集成于單個(gè)微流控芯片，用于E.coli的實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)果表明102CFU/μL的E.coli檢測(cè)用時(shí)為30 min[42]。為提高NASBA的檢測(cè)效率，Zhao Xinyan等致力于改良檢測(cè)過程中RNA的提取方法，先后設(shè)計(jì)免疫提取RNA和膜富集RNA的NASBA微流控芯片，其中，后者的檢測(cè)效果較好[43-44]。膜富集RNA-NASBA應(yīng)用于水中Saccharomyces cerevisiae、S.aureus和E.coli檢測(cè)的LOD均為64 CFU/L。而且該芯片設(shè)計(jì)依照96 孔板的尺寸，熒光強(qiáng)度判定檢測(cè)結(jié)果可使用酶標(biāo)儀完成，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)輸出。Chung等也對(duì)芯片中RNA的提取方法進(jìn)行了改良，并將其應(yīng)用于牡蠣中Norovirus的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)首先將污染的牡蠣進(jìn)行研磨，取上清液注入芯片，然后利用電物理法將病毒吸附在微球上并進(jìn)一步打漿溶解。隨后將提取的RNA轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室，進(jìn)行NASBA擴(kuò)增。經(jīng)體系優(yōu)化后，牡蠣中Norovirus的LOD為102PFU/個(gè)[45]。

NASBA-微流控芯片的檢測(cè)目標(biāo)為RNA，因此樣品中的死細(xì)胞對(duì)檢測(cè)結(jié)果無干擾，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，而且檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低。但是，當(dāng)樣品中大部分為雙鏈DNA時(shí)，NASBA需要95 ℃輔助初始變性；當(dāng)樣品中大部分為RNA時(shí)，需要溫和的熱處理（65 ℃）去除二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，NASBA并非完全等溫?cái)U(kuò)增，對(duì)微流控芯片的設(shè)計(jì)和使用提出了更高要求。

2.4 HDA-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物

HDA是由Vincent等在2004年首次報(bào)道的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)中DNA解旋酶在ATP驅(qū)動(dòng)下打開DNA雙鏈，SSB結(jié)合單鏈DNA防止降解，同時(shí)，一對(duì)與DNA模板互補(bǔ)的特異性引物退火結(jié)合到模板的3’端，此時(shí)，無核酸外切酶活性的大片段DNA聚合酶沿著引物延伸合成新的雙鏈DNA。新合成的雙鏈DNA作為模板在DNA解旋酶的作用下進(jìn)入下一輪擴(kuò)增反應(yīng)，使DNA呈指數(shù)擴(kuò)增[46]。

經(jīng)過近些年的發(fā)展，HDA檢測(cè)的全過程已經(jīng)可以整合至單一芯片。Mahalanabis等通過瓣閥和疏水性排氣孔驅(qū)動(dòng)芯片中的液體流動(dòng)，在單一芯片上完成HDA檢測(cè)的全過程，極大地減少了繁瑣操作。將該芯片用于E.coli檢測(cè)的LOD可達(dá)10 CFU，用時(shí)50 min[47]。另有研究人員利用二氧化硅超順磁粒子進(jìn)行DNA的固相提取和反應(yīng)體系的驅(qū)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)HDA-微流控芯片檢測(cè)分析一體化。該方法以E.coli為模式生物，驗(yàn)證了其可行性[48]。常見的微流控芯片以玻璃、硅和PDMS作為基質(zhì)，雖然實(shí)現(xiàn)了裝置小型化，但仍存在成本相對(duì)較高的問題。紙可以作為降低成本的一種選擇。盡管紙基芯片缺乏高分辨率和高靈敏度，但對(duì)于工業(yè)化程度較低的國(guó)家，尤其是對(duì)需要持續(xù)測(cè)試的情況，紙基芯片成為非常有吸引力的替代裝置[49]。Tang Ruihua等將核酸提取、HDA檢測(cè)和橫向流動(dòng)試紙條分析整合在紙芯片中，對(duì)廢水、果汁、牛奶和雞蛋中的S.typhimurium進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，檢測(cè)特異性高、靈敏度強(qiáng)，廢水和雞蛋中的LOD均為102CFU/mL，牛奶和果汁中的LOD為103CFU/mL，檢測(cè)用時(shí)為1 h左右[50]。

HDA-微流控檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，對(duì)樣品純度要求較低，但是HDA體系中所需酶試劑的價(jià)格較為昂貴，是該技術(shù)應(yīng)用過程中的限制因素。

3 結(jié) 語

雖然目前以核酸為基礎(chǔ)的食品病原微生物檢測(cè)方法已經(jīng)成熟，但是操作過程依賴于大型設(shè)備和熟練操作人員，導(dǎo)致測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)、成本昂貴，且不便于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。核酸-微流控將檢測(cè)全過程集中在一塊芯片中，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，并具有微型化帶來的便攜性和低成本的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合靈活的設(shè)計(jì)可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，具有取代傳統(tǒng)檢測(cè)的潛力。但將核酸-微流控芯片實(shí)際應(yīng)用于食品病原微生物檢測(cè)仍然存在一些挑戰(zhàn)，例如食品的基質(zhì)比較復(fù)雜，需要前處理；檢測(cè)中所有關(guān)鍵步驟需高效集成在單個(gè)微流控芯片；微流控芯片中的反應(yīng)體系體積小，對(duì)傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性要求更高。目前，許多策略如重力、電、磁、聲學(xué)、親和化學(xué)和流體力學(xué)等已經(jīng)用于解決核酸-微流控芯片檢測(cè)食品病原微生物過程中存在的問題，這一領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，需要付出更多努力來促進(jìn)食品病原微生物檢測(cè)的發(fā)展。