人EPCs來源外泌體修復糖尿病大鼠皮膚缺損機制研究

張雁 徐寧

[摘要]目的：探究人EPCs來源外泌體修復糖尿病大鼠皮膚缺損機制。方法：用隨機數字表法將制備成功的糖尿病SD大鼠創面感染動物分為外泌體注射組（10只）和陰性對照組（10只）注射等劑量生理鹽水，紗布覆蓋，比較兩組創面組織VEGF及bFGF水平、創面MVD、創面愈合率等指標。結果：實驗組創面組織VEGF、bFGF水平、CD34陽性細胞表達、創面愈合率均顯著高于對照組，差異均具有統計學意義（P<0.05）。結論：人EPCs來源外泌體可以使糖尿病小鼠皮膚創面血管化加快，創面愈合更加迅速，創面中VEGF、bFGF的表達很可能促進了小鼠的恢復。

[關鍵詞]人EPCs來源外泌體;糖尿病大鼠;皮膚缺損機制

[中圖分類號]R751

[文獻標識碼]A

[文章編號]2096-5249（2021）24-0001-02

創面愈合的過程并不簡單，要使創面愈合效果較好需要細胞增殖移動、細胞外基質分泌沉淀、重生新的血管及組織重新組合等密切配合[1]。在最開始對糖尿病創面研究時，借鑒正常創面的治療方案，后來發現糖尿病導致的創面用正常創面治療的方法在治療效果上大相徑庭，因此找到針對糖尿病造成的創面的治療方法稱為中外醫學工作者迫切解決的難題[2]。老年人的比重越來越大，在中國乃至全世界糖尿病人都顯著增多，對患者生活質量的享受帶來了嚴重的影響，疾病的難治性使患者在治療中有大量的支出，同時社會醫療資源也承受著越來愈多的壓力。如何提高糖尿病造成的創面治療效果一直是困擾醫學工作者的難題，因此越來越多的人參與到該病的研究中[3]。普通創面由于沒有高血糖及身體功能代謝紊亂的影響，因此相較糖尿病創傷較為好痊愈。局部循環失常、創面部位神經壞死病變、細菌感染、細胞活力消失等都是造成創面難愈合的原因[4]。血液中血清是其組成的重要成分之一，血清中外泌體非常多，因此本文對血清外泌體促進組織再生的機制進行了研究，從而證實其促進慢性創面愈合與修復的作用，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料用隨機數字表法將制備成功的糖尿病SD大鼠創面感染動物20只。5周齡，體質量在十五到二十克之間，平均質量為（17.32）g。

1.2方法（1）血清外泌體的提取及鑒定。1對小鼠進行采血，采血后靜止放置六十分鐘，靜置完成后進行離心，離心量為兩千克，0.25小時后將血清分離。離心兩千克，半小時后將細胞碎片去除，將去除后的液體以1毫升為單位分成若干份分別放在其他離心管中。對離心血清提取外泌體，方法參照賽默飛公司外泌體提取說明書。觀察外泌體的各方面狀態（利用電子透射顯微鏡）。2Western blot檢測外泌體的特異性蛋白CD63和HSP70的表達。用BCA法測提取的外泌體的濃度，根據檢測結果計算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉膜，用TBS/T洗3次，在室溫狀態下用脫脂奶粉封閉120分鐘，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000;HSP70，1：1000），將冰箱溫度調整到四攝氏度，將樣品放置一晚。將一抗回收后，TBS/T洗3次，將相應二抗加入，在室溫條件下孵育60分鐘。TBS/T洗三次，顯影、定影。（2）糖尿病SD大鼠動物模型的制備。選擇成年、無任何疾病、SPF級SD大鼠20只，雄性和雌性各占一半。將鏈脲佐菌素（STZ）通過大鼠尾巴進行靜脈注射，注射量為每千克七十毫克，對注射小鼠測量尾靜脈血糖，觀測頻率為每兩天觀測一次，一周內觀測兩次。如果血糖濃度超過22.2mmol/L則糖尿病模型制備成功，將其放入專門地方進行喂養。（3）糖尿病SD大鼠動物感染創面模型的建立。實驗前24小時將大鼠十五平方厘米的背毛用百分之八的硫化鈉去除。稱取大鼠的體重，根據體重配置合適劑量的麻醉劑，用百分之零點五的碘伏消毒后注射。將皮膚全層隔開割開，將兩到三平方厘米的皮膚全層取出，制造創面。將標準金黃色葡萄球菌涂抹到創面，間斷縫合，一天后再次用相同藥物處理創面，感染創面大鼠模型制備成功。

1.3觀察指標與評價方法（1）創面組織VEGF、bFGF：取上清雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測其中VEGF、bFGF水平。（2）創面MVD：對創面進行血管化監測。（3）創面愈合評估：對創面傷口愈合檢測。（4）創面愈合觀察：創面愈合率（%）=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積。

1.4統計學方法研究中數據用SPSS22.0統計分析，計量資料（x±s）表示，用t進行檢驗分析。P<0.05則差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組創面組織VEGF、bFGF比較實驗組創面組織VEGF、bFGF水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.2兩組創面MVD比較實驗組CD34陽性細胞表達明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3兩組創面愈合評估分別在3、7、14和21天時用外泌體治療的傷口的大體視圖

2.4兩組創面愈合率比較實驗組創面愈合率顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。

3討論

如今危害人類健康的慢性疾病種類不斷發展，隨著生活的變化糖尿病對人們的影響程度僅次于腫瘤和心血管疾病，美國有約2000萬的人口因糖尿病而生活痛苦，在糖尿病患者中有大約四分之一的患者創面很難治愈[5]。患者因體內一些功能發生變化會導致神經功能異常、血液粘稠導致阻塞動脈以及骨關節發生病變，創面產生的很大一部分原因是因為以上并發癥導致的[6]。

外泌體是直徑在二十到一百四十納米的微小囊泡，它是一種多泡體，形成方式為細胞內膜出芽方式，它能夠將信息在各細胞間進行傳遞，很多的生理病理過程都與它有關。組織修復中外泌體的作用也極其重要，血小板MVB外模內陷形成外泌體，血小板質膜融合MVB后，將其由胞吐的方式釋放[7]。隨著對外泌體的不斷鉆研，培養的細胞類型都是可分泌外泌體，在體液中就有外泌體自然存在，如腦脊液、血液中等。隨著對外泌體的深入了解，組織修復中運用外泌體發揮了不可替代的作用。EPCs具有游走特性，可促進未成熟的內皮細胞不斷增殖、分化，表面標志物的表達與造血干細胞相同，可分泌有利于血管生成的的生長因子。EPCs因可促進血管生成以及可修復局部缺血組織，因此被越來越多的應用于促進創面愈合中。

通過分析實驗組在創面組織VEGF及bFGF水平、創面MVD、創面愈合率等指標上均優于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。

綜上所述，人EPCs來源外泌體修復糖尿病大鼠皮膚缺損中的應用效果顯著，值得推廣。

參考文獻

[1]徐兵，李海樂，劉丹平，等.骨髓源內皮祖細胞分泌的外泌體對大鼠創傷性皮膚缺損修復的促進作用[J].吉林大學學報：醫學版，2017，43（4）：180-181.

[2]李羅成，王志維，吳紅兵，等.內皮祖細胞來源的外泌體減輕血管內皮細胞缺氧性損傷[J].微循環學雜志，2019，25（4）：177-178.

[3]熊武，孫安夢，皇毅，等.內皮祖細胞外泌體中與血管生成相關的miRNAs生物信息學分析[J].中國醫師雜志，2019，21（04）：27-30.

[4]何強，張培華.間充質干細胞來源外泌體在創面修復中的作用及其機制研究進展[J].中國美容醫學，2018，27（09）：147-152.

[5]袁葉青，包玉倩.外泌體參與糖尿病發生的機制研究[J].國際內分泌代謝雜志，2018，38（2）：102-105..

[6]林文東，李振喜，施水液，等.大鼠糖尿病動物模型建立及參芪復方干預作用機制研究[J].世界復合醫學，2018，4（03）：11-13.

[7]徐江平，郭海彪，汪海濤，等.鼠神經生長因子對糖尿病大鼠皮膚損傷的促愈合作用[J].湖北理工學院學報，2015，31（03）：51-56.

基金項目：江蘇大學臨床發展基金（JLY20180126）

通信作者：徐寧，E-mail：xuning83@163.com