膽道閉鎖的遺傳學研究進展*

潘東明，劉磊

（深圳市第三人民醫院/南方科技大學第二附屬醫院1.兒科；2.醫院辦公室，廣東 深圳 518112）

膽道閉鎖（biliary atresia,BA）是新生兒期發生的嚴重肝膽系統疾病，以肝內和肝外膽管的進行性炎癥和纖維性梗阻為特征，是目前兒童肝臟移植的重要原因之一。膽道閉鎖發病率具有種族和地區差異，亞洲發病率高于歐美，中國大陸相關BA 發病率數據統計不全面，中國臺灣地區為1.78/10000［1］。根據2018 版膽道閉鎖診斷及治療指南［2］，肝門空腸吻合術（Kasai 手術）應當作為膽道閉鎖的首選治療方案，Kasai 手術后出現肝衰竭或者肝功能失代償需要進行肝移植手術治療。

膽道閉鎖目前病因尚不明確，遺傳因素、病毒感染、環境因素等都在其中發揮作用。本文將從遺傳角度系統梳理膽道閉鎖的病因學最新研究進展，包括表觀、基因多態性、單基因突變三個方面。

1 DNA 甲基化與膽道閉鎖

DNA 甲基化是表觀遺傳的主要形式之一，其主要參與基因表達調控、重金屬修飾、蛋白質功能調節以及核糖核酸加工，基因組DNA 甲基化狀態改變會引起基因表達異常或染色體結構的不穩定［3］。大量研究證實DNA 甲基化與多種疾病如癌癥、印記基因疾病、自身免疫疾病、代謝疾病、神經系統疾病的發生發展有關［4-5］。

現有研究發現多個基因的甲基化與膽道閉鎖存在關聯，如Foxp3、Alu 與長散在重復序列-1（LINE-1）、ITGAL、γ-干擾素（IFN-γ）、ATX。

Foxp3 是控制Treg 細胞發育和功能的關鍵轉錄因子，其在多種肝臟疾病中存在異常表達修飾，進而調節Treg 細胞的功能影響疾病的發生發展［6-7］。LI 等［8］研究發現，相比正常對照，膽道閉鎖患者與小鼠模型中Treg 細胞的Foxp3 啟動子區CpG 島存在顯著高甲基化。在恒河猴輪狀病毒感染的膽道閉鎖小鼠模型中，通過注射甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine,5-Aza）可以一定程度緩解膽道閉鎖癥狀。并且注射5-氮雜胞苷小鼠相比未注射的感染模型，其Treg 細胞具有更好的抑制功能。因此推測Treg 細胞中Foxp3 啟動子區異常的甲基化狀態將損傷Treg 細胞抑制功能，進一步加重膽道閉鎖的炎癥損傷程度。

Alu 和LINE-1 元件是逆轉錄轉座子，在人類基因組中普遍存在，會導致基因組不穩定，特別是與端粒長度有關。UDOMSINPRASERT 等［9］研究發現，膽道閉鎖患者相比健康對照，其外周血Alu 與LINE-1 顯著低甲基化。LINE-1 甲基化與患者肝纖維化程度相關，并且膽道閉鎖患者中Alu和LINE-1 的甲基化與端粒長度呈正相關，低甲基化的患者端粒長度更短，其轉錄活性升高的同時增加機體氧化應激對DNA 的損傷。

CD4+T 細胞的ITGAL 啟動子調控元件低甲基化引起表達升高在很多自身免疫疾病患者中廣泛出現［10］。DONG 等［11］通過測量膽道閉鎖患者與健康對照的CD4+T 細胞ITGAL 的基因表達與甲基化狀態發現，ITGAL 在膽道閉鎖患者CD4+T 細胞中顯著下調，這與其啟動子區高甲基化相關。通過DNA 甲基化抑制劑治療后，ITGAL 啟動子甲基化下調，其基因表達上調。

IFN-γ 是機體發揮固有免疫應答和適應性免疫應答反應中重要的細胞因子，IFN-γ 異常表達會導致一些自身炎癥和免疫性疾病的發生。DONG等［12］研究發現膽道閉鎖患者CD4+T 細胞IFN-γ 表達相比健康對照顯著增高，IFN-γ 基因啟動子區域存在顯著低甲基化。YANG 等［13］進一步研究膽道閉鎖患者中miR-29b/142-5p 對IFN-γ 基因甲基化的調控作用。研究發現，患者中miR-142-5p、DNMT1 高表達，miR-29b 與DNMT3a/DNMT3b 的表達在膽道閉鎖的肝臟中呈現負相關，并且LINE-1、Alu、SAT2 和IFN-γ 啟動子區域存在低甲基化，IFN-γ 的表達上調。最終，研究推斷miRNA-29b/142-5p 的高表達可以抑制DNMTs 表達，導致甲基化降低，進而IFN-γ 基因過表達。

UDOMSINPRASERT 等［14］通過對65 個膽道閉鎖患者與65 個正常對照的外周血ATX 基因進行甲基化檢測與表達量檢測，結果發現，膽道閉鎖患者ATX 基因的啟動子區特定的CpG 島存在低甲基化，并且膽道閉鎖晚期相比早期患者甲基化程度更低。并且，啟動子低甲基化、ATX 過表達與膽道閉鎖患者的黃疸狀態、肝功能障礙以及肝臟僵硬程度相關聯。

綜上，Foxp3 啟動子CpG 島的高甲基化會損傷Treg 細胞抑制功能，加重膽道閉鎖發生的炎癥損傷。Alu 和LINE-1 低甲基化，可能增加機體氧化應激對DNA 的損傷，導致肝纖維化程度加重。TGAL 啟動子區低甲基化，可能引起T 細胞功能異常。IFN-γ 啟動子區低甲基化，可能誘導慢性炎癥反應，促進膽道閉鎖的發展。以上研究可以看到DNA 甲基化在膽道閉鎖中發揮重要作用，特別是影響免疫細胞功能或者參與機體氧化應激造成炎性損傷。ATX 啟動子區的低甲基化導致其蛋白過表達，促進肝纖維化進程。目前還沒有對膽道閉鎖全基因組層面的相關研究，新的組學技術的發展特別是單細胞甲基化測序技術的發展如scRRBS、scBS-seq、scWGBS 等將進一步推動領域的研究［15］。

2 基因多態性與膽道閉鎖

基因的多態性可能導致肝臟的炎癥以及纖維化的易感性增強，通過不同的SNP 基因分型技術可以研究特定基因的分型與膽道閉鎖的關聯［16］。目前已經報道與膽道閉鎖相關的基因多態性基因包 括 EFEMP1［17］、ADIPOQ［18］、ITGB2［19］、VEGF［20］、USF2［21-22］、ADD3［23-28］、GPC1［29］、ARF6［30］、IFNG［31］、MIF［32］、ICAM1［33］等。

GARCIA-BARCELó 等［23］在包含200 中國膽道閉鎖患者與481 個健康對照的隊列中采用全基因組關聯分析尋找膽道閉鎖的風險位點，結果發現包含XPNPEP1 與ADD3 的區域的多個突變與膽道閉鎖風險較高。CHENG 等［24］擴展了先前的研究，在包含339 個膽道閉鎖患者與401 個健康對照的隊列對10q24.2 的107 個SNP 位點進行檢測，發現rs17095355 位點最顯著相關，10q24.2 區域的SNP 位點通過調節肝中ADD3 的表達，可能在一定程度引起膽道閉鎖。在先前的研究中［27］，漢族人群隊列（134 膽道閉鎖患者與618 個健康對照）中對ADD3 的兩個風險位點也進行了驗證。結果發現SNP rs17095355 在共顯性模型中與膽道閉鎖相關，rs10509906 在加性模型下與膽道閉鎖相關。并且T(a)-G(b)（a 為rs17095355,b 為rs10509906）基因型相比C(a)-C(b)基因型風險顯著升高。WANG 等［25］選擇了ADD3 的三個SNP 風險位點在510 個膽道閉鎖患者與1 473 個健康對照的隊列中進行驗證。分析結果顯示，rs17095355 與rs2501577 兩個位點在該隊列證實與膽道閉鎖相關聯。LAOCHAREONSUK 等［26］在泰國嬰兒隊列（56 個膽道閉鎖患者與166 個健康對照）中對ADD3 的三個位點（rs2501577,rs11194981,rs12268910）進行驗證。分析結果支持三個位點在膽道閉鎖患者中顯著高于對照，并且rs17095355與rs2501577 累加具有更高風險。

CHEN 等［17］對歐美隊列343 個散發膽道閉鎖患者與1716 個健康對照進行GWAS 分析，Meta分析發現三個與膽道閉鎖高度相關的SNP 位點，位于2p16.1（rs10865291,rs6761893,and rs 727878；P<5×10-8），這些SNP 位于EFEMP1 基因的5 號內含子。基因表達檢測發現膽道閉鎖患者的EFEMP1 表達量更高，免疫組化結果顯示，EFEMP1 在膽道閉鎖患者的肝臟標本中的膽管細胞和血管平滑肌細胞中表達，但在正常對照肝臟樣本中的膽管細胞中則沒有表達。因此，EFEMP1 是膽道閉鎖的潛在風險基因。

HUANG 等［21］在包含52 個膽道閉鎖患者與96個健康對照的隊列研究USF2 rs916145 與疾病的關聯，結果發現rs916145 的C 等位基因在膽道閉鎖患者中頻率更高。但是該結論在更大隊列并未得到證實。CHEN 等［22］在中國南方人群隊列中研究USF2 rs916145 與膽道閉鎖的關聯，該隊列包含506 個膽道閉鎖患者與1 473 個健康對照。結果發現不同基因型不存在顯著統計學差異，USF2 rs916145 多態性與膽道閉鎖不存在關聯。

通過以上研究可以看到，采用全基因組關聯分析結合現有數據庫，可以為諸如膽道閉鎖之類疾病的風險位點研究提供全局線索。而針對同一SNP 位點，不同遺傳背景、甚至樣本數量都可能影響對風險位點的評估。因此，要闡明膽道閉鎖的病因，全基因組關聯研究以及相關的數據共享將尤為重要。

3 單基因突變與膽道閉鎖

膽道閉鎖患兒出生時約20%存在肝膽系統形態學發育異常，并且常伴有多發畸形，提示膽道閉鎖可能與染色體異常、膽管發育調控相關基因有關。GIRARD 等［28］對目前在膽道閉鎖患者中報道的染色體異常、基因突變與相關綜合征進行了總結。對于染色體異常，多數報道為染色體重復如18 三體、貓眼綜合征相關的22 三體或者四體。CHENG 等［34］對包含89 個三期非綜合征膽道閉鎖患者隊列開展全基因組拷貝數突變分析。結果發現29 個膽道閉鎖相關的拷貝數變異，這些拷貝數變異區域包含的基因富集在炎癥相關通路，提示免疫-炎癥在膽道閉鎖中的重要作用。但是目前沒有發現與膽道閉鎖明確相關的單一致病染色體異常。

對于單基因疾病，目前案例報道較多［28］，部分基因與肝臟疾病相關，如JAG1［35］、PKHD1［36］等。JAG1 是Alagille 綜合征的致病基因，該疾病為常染色體顯性遺傳，并且存在外顯不全。PKHD1 為常染色體隱性多囊性腎病的致病基因，該疾病與肝囊腫以及纖維化相關。SANGKHATHAT 等［35］對20 個膽道閉鎖患者進行全外顯子測序，重點分析19 個嬰兒膽汁淤積癥相關基因，結果發現8 個基因存在雜合突變（MYO5B、ABCC2、ABCB11、UGT1A1、MLL2、ERCC4、KCNH1、JAG1），但是這些患者并不存在相關疾病癥狀，提示這些突變可能是偶發，并不一定與膽道閉鎖相關聯。與此同時，部分案例報道了膽道閉鎖中與肝臟無關的基因的突變，如CFC1、ZIC3，這些基因與膽道閉鎖的關聯需要更多研究［28］。

在以上不同的案例報道和研究中，部分基因突變導致疾病與膽道閉鎖存在一定關聯，但是其作用更像是一種累加因素，并不是膽道閉鎖的決定原因。部分結果由于是基于散發案例的報道，其更可能是偶發因素，基于現有結果無法判斷其與膽道閉鎖的關聯。隨著全外顯子/全基因組測序在臨床診斷中的應用普及，利用其在拷貝數變異、結構變異分析中的分析優勢，相信未來對于膽道閉鎖的致病基因將會不斷加深，發掘出更多的相關基因。

除了以上表觀與基因組層面，microRNA 與膽道閉鎖的關聯也存在大量研究。研究發現，miR-200a/b、miR-21、miR-29、miR-222 在膽道閉鎖肝纖維化中發揮重要作用，且多項研究證實，microRNA 可協同多個基因，形成復雜的纖維化網絡途徑［37］。

隨著測序技術的發展與應用，基于臨床隊列的研究不斷發掘新的膽道閉鎖相關基因，這些基因從免疫反應、炎癥、遺傳易感性、纖維化等諸多方面，揭示膽道閉鎖的致病機制，這些研究將可能為膽道閉鎖的診斷、治療提供更多新的視角，與此同時為膽道閉鎖的臨床精準治療提供新的可能靶點。