治療性藥物監測在結核病治療中的應用進展

王樂樂 楊松 唐神結

2020年10月，世界衛生組織(WHO)發布了最新的全球結核病報告，全球新發結核病患者發病率為130/10萬，我國結核病患者發病率為58/10萬，結核病的治療成功率為85%，耐藥結核病治療成功率僅為57%[1]。結核病患者由于個體差異、藥品毒性、耐藥等多種原因影響治療效果。目前指導合理使用抗結核藥品的手段包括WHO推薦的按體質量推算藥品劑量、療效評估、代謝酶基因分型和治療性藥物監測(therapeutic drug monitoring，TDM)。基因分型有助于早期用藥決策，TDM以患者-藥品-效果之間的關系為主要目標[2]，幫助患者達到最佳療效，減少耐藥及不良反應的發生。因此，筆者通過對抗結核藥品TDM的最新文獻進行綜述，以提高臨床醫師對TDM的重視程度。

一、TDM的定義和臨床意義

1.定義[2]：TDM是指通過測定患者體內藥品暴露、藥理標志物或藥效學指標，利用定量藥理模型，以藥品治療窗為基準，為患者制定合適的個體化治療方案。其核心目的是利用藥品分析、定量計算、臨床干預以獲得最大化合理用藥。生物樣本中的藥品濃度、藥理標志物和藥品相關基因水平均是治療方案優化的物質基礎。

2.臨床意義：雖然目前的結核病患者多進行規范化抗結核治療，但88%的患者利福平血藥濃度低于推薦的截斷值(8 mg/L)[3]；環絲氨酸(54.87%)和利奈唑胺(16.9%)血藥濃度不在有效濃度范圍[4]；血藥濃度-時間曲線下面積以及達峰時間差異大[5-7]；氟喹諾酮類藥品易導致不良反應，臨床給藥劑量偏低[8]。這些原因均可導致治療結果欠佳。藥物濃度雖然不能直接體現結核病患者對治療的反應程度，但結合臨床和細菌學檢查結果，TDM可以成為一種決定性工具[9]，將最低抑菌濃度(MIC)和藥物濃度聯合作為標志物，對結核病患者實現合理用藥具有較高的應用價值，對維持最佳治療藥物濃度，進行精準醫療具有重要的意義[4,10-11]。

二、TDM的檢測技術

TDM的檢測方法包括直接法和間接法，可代替目前常用的線性回歸模型[12]。目前常用的主要有高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、超高效液相色譜-質譜串聯法(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)、血漿抗結核藥物活性測定(plasma TB drug activity，TDA)以及離子交換樹脂旋轉柱離心法。

1.HPLC法：HPLC是在經典的液相色譜法的基礎上合并氣相色譜，20世紀60年代后期迅速發展并得到廣泛應用。其可對樣品中的目標物質進行準確分離、含量測定，具有快速、高效、特異度和敏感度高、操作簡便等優點[13]。采用HPLC同時測定異煙肼、吡嗪酰胺和利福平血藥濃度，標準曲線線性良好(r2>0.99)，準確度為96.5%～106.6%，日間精密度相對標準偏差(RSD)均<15%，已成功應用于群體藥代動力學研究[14]；同時測定二線抗結核藥品莫西沙星、利奈唑胺、氯法齊明的血藥濃度，日內和日間準確度、精密度(RSD<13.2%)、線性(r>0.9970)良好、平均提取回收率[(87.3±11.0)%～(107.4±6.8)%]和穩定性(86.5%～105.3%)均在可接受范圍[15]；檢測結核病患者胸腔積液中異煙肼濃度，在0.25～10.00 μg/ml范圍內線性關系良好(r=0.9989)，回收率分別為97.95%、100.64%、102.84%，日內準確度RSD<5%，日間準確度RSD<6%[16]。

2.LC-MS：LC-MS[4]是一種分離分析復雜有機混合物的有效手段，具有分析范圍廣、能力強、時間短、結果可靠、操作簡便等優點。

液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)可同時對多種一線抗結核藥物進行檢測，線性良好(r>0.997)，日內、日間準確度和精密度、穩定性RSD均<15%，該方法已成功獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)認證，進樣量小(10 μl)，采血量僅需3 ml，為兒童抗結核藥品水平的評估和監測增加了優勢[12]。LC-MS/MS檢測結核性腦膜炎患者腦脊液利福霉素濃度，在0.4～4.0 μg/ml濃度范圍內線性良好(r=0.9997)，精密度和穩定性RSD分別為2.9%和4.1%，檢測限為100 ng/ml時，信噪比S/N可提高至3.6[17]。與HPLC相比，LC-MS/MS測定利奈唑胺的定量范圍為0.05～30.00 μg/ml，HPLC為0.25～30.00 μg/ml，定量下限更低，LC-MS/MS特異度和敏感度更高，但兩種方法一致性較好，無系統偏倚[18]。

液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜(LC-QToF-MS)：于2011年開始用于化合物分離和純度分析、生物標記物定性檢測、藥品開發中代謝產物的發現和鑒定。目前國內外LC-QToF-MS多用于代謝組學研究以及定性分析。LC-QToF-MS同時測定乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺和利福平的定量范圍分別為0.2～5.0 μg/ml、0.2～7.5 μg/ml、1～40 μg/ml、0.25～2.00 μg/ml，選擇性好，具有足夠的精密度和準確度，已通過巴西國家衛生監督局(ANVISA)和美國FDA驗證，可應用于TDM[19]。

3.UPLC-MS/MS：經典的HPLC法，敏感度較低，線性范圍較窄，無法滿足臨床所需的大量藥物濃度檢測要求。李岑等[20]研究結果顯示，UPLC-MS/MS測定多索茶堿的線性范圍為0.01～24.90 μg/ml、檢出限低至1 ng/ml，與HPLC(1.0～24.9 μg/ml、0.3 μg/ml)相比，敏感度提高300倍，柱寬顯著改善；UPLC-MS/MS前處理步驟簡化，對樣品基質的影響降低，節約成本，準確度和精密度提高，使TDM的應用更廣泛。UPLC-MS/MS法同時檢測5種一線抗結核藥品，日內和日間RSD均<17.0%，準確度為91.5%～110.0%，提取回收率均≥90.2%，分析時間僅需3.5 min[21]；檢測10種一線抗結核藥品和4種二線抗結核藥品濃度，分析時間僅需7 min，線性關系良好(r>0.99)[22]。

4.TDA：2011年TDA首先用于間接檢測患者藥物暴露量，利用患者血漿(含抗結核藥品)和對照血漿(無抗結核藥品)結核分枝桿菌(MTB)檢出時間的比值計算TDA。Niward 等[23]發現利福平血藥濃度低于8 mg/L的患者TDA明顯降低(P=0.0013)，TDA<1.5的患者利福平血藥濃度明顯降低(P<0.001)。TDA適合于醫療條件不足、結核病高發、難以使用LC-MS但具有MTB培養條件的地區，但將TDA作為結核病治療的常規管理工具還需要進一步研究[3,23]。

5.離子交換樹脂旋轉柱離心法：離子交換樹脂旋轉柱離心法是從結核病患者尿液中間接檢測藥物濃度的方法，但敏感度較好、特異度較差[24]。

從藥品專屬性上，中國藥理學會治療藥物監測研究專業委員會推薦采用LC-MS/MS和HPLC[2]。HPLC檢測限較高，低濃度樣本不適用[25]；LC-MS通過色譜和質譜之間的互補，分離能力、敏感度和選擇性較HPLC高；UPLC-MS/MS可使分析通量、敏感度和色譜峰容量進一步增加[26]。

三、TDM在結核病治療中的應用進展

目前尚無抗結核藥品TDM的相關技術指南[27]。但最近更新的WHO[28]和美國胸科協會(ATS)指南[29]中均推薦對有藥物暴露改變風險或預后不良的結核病患者在治療期間應行TDM的建議，為用藥方案調整提供依據[30]。

TDM適用于早期依從性較差的患者和耐藥發生率較高的國家。異煙肼的快乙酰化基因型患者(亞洲人最常見)比慢乙酰化基因型患者更易發生治療失敗和復發，故TDM對于這類人群具有重要意義。對痰培養陰轉慢、有藥物間相互作用和并發癥(如并發糖尿病、艾滋病、胃腸道功能紊亂和其他吸收不良疾病)的患者應優先選擇進行TDM[31]。為避免敏感結核病因血藥濃度過低、反應延遲進展為耐藥結核病，治療2周后行TDM也很有必要。

1.敏感結核病：過去TDM多對一個時間點的血藥濃度進行分析，Kumar等[32]、Lei等[33]同時對多種一線抗結核藥品行TDM發現，規律抗結核治療的敏感結核病患者異煙肼和利福平血藥濃度在治療第1個月、強化期結束時和抗結核治療結束時差異無統計學意義[32]，但服藥后2 h的參考意義最大[34]。給藥劑量是決定血藥濃度水平最重要的因素，患者性別、年齡、體質量、吸煙史、肌酐清除率、血清白蛋白以及結核病史也對血藥濃度存在影響，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇濃度與給藥劑量、性別(女性)呈正相關(P<0.05)，利福平、異煙肼和乙胺丁醇血藥濃度與年齡呈正相關(P<0.05)；異煙肼血藥濃度與體質量呈負相關(P<0.01)；利福平、異煙肼與吸煙史呈正相關(P<0.05)；利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇血藥濃度與肌酐清除率(Ccr)呈負相關(P<0.05)：利福平與血清白蛋白呈正相關(P<0.01)，與吡嗪酰胺血藥濃度呈負相關(P<0.05)；有結核病史的患者異煙肼血藥濃度高于初治結核病患者(P<0.05)。多因素分析顯示：異煙肼給藥劑量每增加1 mg/kg，異煙肼2 h血藥濃度增加0.249 g/ml；利福平劑量每增加1 mg/kg，2 h血藥濃度增加0.270 μg/ml；吡嗪酰胺劑量每增加1 mg/kg，2 h血藥濃度增加0.190 μg/ml(P值均<0.01)；乙胺丁醇劑量每增加1 mg/kg，2 h血藥濃度增加0.145 μg/ml，Ccr每增加1 ml/min，2 h血藥濃度下降0.155 μg/ml(P值均<0.05)[32-33]。

2.耐藥結核病：WHO和ATS指南均推薦二線抗結核藥品應使用TDM，特別是利奈唑胺和環絲氨酸、特立齊酮、氟喹諾酮類和氨基糖苷類注射劑[28-29]。美國感染病協會(Infectious Disease Society of America，IDSA)等多個國際組織推薦耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)患者常規應用TDM。但目前對MDR-TB的研究較少，僅僅幾項研究同時涉及細菌的MIC和藥物濃度[35-36]。

Bolhuis等[10]對收治的全部MDR-TB患者的部分二線抗結核藥品長期行TDM，結合MIC和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，治療成功率高達86%。Yu等[37]發現90% MTB菌株對環絲氨酸MIC低于32 μg/ml(截斷值)，34.6%的患者(劑量500 mg/d)峰濃度(Cmax)<20 μg/ml，61.9%的患者(劑量750 mg/d)Cmax>35 μg/ml，Cmax/MIC>1的患者治療效果較好(P<0.05)。因此Cmax/MIC可能是預測MDR-TB/XDR-TB患者預后良好的重要指標。WHO指南推薦MDR-TB患者阿米卡星的給藥劑量為15 mg·kg-1·d-1，每日最大劑量1000 mg[38]。Cmax/MIC>20和血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)/MIC>100是評估氨基糖苷類藥品療效的重要參數[8,39]；平均累積AUC0～24是聽力損傷的預測因子，AUC0～24>87 232 mg·h/L時，耳毒性可增加10%[40]。van Altena等[39]在TDM下將阿米卡星給藥劑量減少至400.0 mg/d，平均累積AUC0～24=15 205 mg·h/L，Cmax/MIC=31.2，67.3%的患者可獲得滿意療效，沒有復發，聽力損傷發生率(9.1%)較低。在模擬人體的空纖維感染模型中，當莫西沙星給藥劑量為400 mg(MIC=0.25 mg/L)時，40%的患者發生耐藥，患者藥物暴露量可相差9倍；以AUC/MIC>100為依據，將莫西沙星劑量增加至800 mg時患者不良反應發生風險并未增加[8]。

由于樣本采集有創、保存條件較高、檢測設備資金投入大等問題，抗結核藥品的TDM并沒有被醫療機構常規采用。Metcalfe等[41]以頭發作為標本對不同時間點的11種二線抗結核藥品同時行TDM，發現低藥物濃度與不良結局明顯相關(HR=0.60，95%CI：0.27～1.34；P=0.210)。Reckers等[42]的研究結果也驗證了此方法的可行性，11種抗結核藥品的定量下限范圍為0.01～1.00 ng/mg，其中9種在線性動態范圍內。頭發采集是非侵入性操作，采集或運輸技術要求低，頭發中的藥物水平能客觀評估患者一段時間(甚至是幾個月前)的平均暴露水平，還可以與血藥濃度結合，分別從時間點和時間段提供信息，這些特點為藥物水平監測提供了可行性。

與血漿或血清相比，干血斑表現出更高的穩定性，可在室溫下運輸甚至郵寄。但由于其對檢測技術人員水平要求較高，只能在具備相應條件的醫療機構開展，阻礙了其大規模實施[43]。因此，目前僅用于少數幾種二線抗結核藥品的評價[11,44]。

唾液或尿液等樣本為無創采集，通過簡單的紫外分光光度計便可測定藥物濃度，可以在社區使用，適用于兒童。van den Elsen等[45]對42項應用唾液行TDM的研究進行了系統評價，結果發現大多數抗結核藥品在唾液中含量非常低，但加替沙星、利奈唑胺、異煙肼、莫西沙星、環丙沙星和克拉霉素的唾液-血清濃度比值大于1，可以通過唾液行TDM。但目前尚需更多抗結核藥品的體內藥代動力學研究，擴大樣本量、優化設計方案，以確定更合適的給藥劑量、取樣方法和分析方法。

有限采樣策略(LSS)模型通過少量的樣本，對AUC進行估算，為TDM提供參考。目前對最佳的LSS研究提示：左氧氟沙星最佳采樣時間為給藥后4 h和8 h；利奈唑胺為給藥后2 h和6 h；莫西沙星為給藥前和給藥后6 h，若莫西沙星合用利福平則為給藥后1 h和6 h[46-47]。

3.結核病并發其他疾病：Alffenaar等[48]提示TDM推薦用于嚴重胃腸道異常、糖尿病、艾滋病、腎損傷或透析患者等。糖尿病是異煙肼和利福平暴露降低的獨立預測因子。結核病并發糖尿病患者與未并發糖尿病患者相比，異煙肼的總暴露量、Cmax分別下降了49.1%和42.9%(P<0.05)，利福平總暴露量、Cmax分別下降了25.0%和11.2%(P>0.05)，吡嗪酰胺總暴露量和Cmax分別下降了15.7%和9.7%[49]。無論是否并發糖尿病，大多數患者使用目前指南推薦的利福平劑量，并不能達到有效Cmax，可在TDM指導下適當增加劑量[50]。Dekkers等[51]報道了1例47歲肺結核并發糖尿病患者，TDM顯示所有藥物的血藥濃度低于有效范圍，增加利福平的給藥劑量至1800 mg，患者未出現明顯不良反應。可見，高劑量的利福平(每日最多35 mg/kg)對肺結核患者是安全和可耐受的[52]，并且還用于MDR-TB治療。但目前仍缺乏對其他抗結核藥品的前瞻性研究。

Ouedraogo等[53]對結核病并發艾滋病患者行TDM發現，利福布汀給藥劑量為150 mg時，洛匹那韋Cmax和AUC0～12分別為20 μg/ml和111.8 μg·h/ml，利托那韋AUC0～12為12.7 μg·h/ml；利福布汀給藥劑量為300 mg時，洛匹那韋Cmax和AUC0～12分別為7.7和69.9 μg·h/ml，利托那韋AUC0-12為6.6 μg·h/ml，但這種藥物暴露改變尚需進一步的研究驗證和分析。

Takayoshi等[54]報道了1例心臟移植并發結核性腦膜炎，聯用利福布汀和環孢素的患者，行TDM發現在使用利福布汀7 d后環孢素的濃度下降28%，21 d后藥物清除增加1.4倍，利福布汀治療期間密切監測環孢素血藥濃度，可降低心臟移植患者因環孢素引起的過度免疫抑制。

4.兒童結核病：大多數兒童對一線抗結核藥物耐受性較好，最常見的不良反應是胃腸不適。盡管肝毒性不常見，但對肝功能的潛在長期影響仍要求對所有患兒定期通過癥狀篩查和體格檢查進行評估。TDM應考慮用于患有嚴重疾病的兒童或擔心藥物吸收或代謝改變的兒童[55]。Garcia-Prats等[56]在TDM下發現，利奈唑胺在兒童中的暴露高于成人，以每日最大劑量600 mg給藥，長期隨訪的17例患兒中10例發生不良反應，57.2%的患兒血紅蛋白降低，停用利奈唑胺后劑量減半重新給藥，4.8%的患兒發生周圍神經病變，停藥后減量給藥，不良反應未再出現。利奈唑胺AUC/MIC>100可獲得滿意療效，AUC/MIC<96或谷濃度<2 mg/L不良反應風險明顯降低。但該前瞻性研究未納入6個月以下的患兒，且尚需更多研究為利奈唑胺用于結核病患兒的最佳劑量提供明確指導。有研究顯示，以兒童干血斑作為樣本行TDM，利福平和吡嗪酰胺血藥濃度準確度較高，乙胺丁醇血藥濃度準確度較低，具體原因有待進一步研究[57]。有研究對結核性腦膜炎患兒腦脊液行TDM發現，異煙肼和吡嗪酰胺穿透腦脊液的能力良好，利福平穿透腦脊液的能力較差，且與腦脊液蛋白水平呈正相關(P<0.05)，增加利福平劑量至50 mg·kg-1·d-1才能達到有效濃度[58]。

四、展望

適當的藥物選擇和精確的給藥劑量是保證患者療效、減少耐藥風險和預防不良反應的最佳策略，也是TDM的最終目標[47]。宿主、病原體、藥物等相關因素可用于TDM的方案制定[43]。基于監測頻率、專業技術水平、操作檢測所需的設備和成本，有研究建議可在3個層面進行劃分，以保證TDM規范化實施[47]：(1)社區層面：采用紫外線分光光度計對唾液或尿液中關鍵的一線(利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)和二線抗結核藥品(氟喹諾酮類、利奈唑胺)進行TDM，以確定藥品暴露情況，制定常規用藥方案；(2)地區層面：對治療效果不佳和發生不良反應的患者，采用HPLC、LC-MS等對關鍵的一線和二線藥品行TDM，制定個體化給藥方案；(3)國家層面：疑難病例收集干燥樣本(血液、唾液)行TDM，可進行全國專家會診和討論，制定最優給藥方案。

目前尚需更多的隨機對照研究，更需要以藥理遺傳學為基礎，為個體化治療提供確切的依據：如NAT2慢代謝型使用低劑量的異煙肼，SLCO1B1基因功能缺失的患者使用高劑量利福平；還需要對結核病并發糖尿病、艾滋病、器官移植患者，孕婦和兒童并發MDR-TB患者應用TDM進行更多研究，為臨床醫師制定治療方案提供參考。