耐多藥結核病診斷方法研究進展

張春霞 徐貴生 時金艷

結核病作為全球十大死因之一，是重大的公共衛生問題，其中耐多藥結核病嚴重威脅人類健康，成為我國結核病控制的難點和重點問題[1]。世界衛生組織2020年全球結核病報告顯示，2019年全球范圍內估計有1000萬例新發結核病患者，約3.3%(46.5萬例)的初治患者和18%的復治患者對利福平耐藥，其中耐多藥結核病患者約占78%，為36.3萬例[2]。耐多藥結核病患者治療時間長達2年，治療藥品由多種二線抗結核藥品組成，這些藥品對患者的不良反應大，對耐多藥結核病患者的治療成功率僅為54.0%[3-4]。耐多藥結核病的診斷對其防治具有重要意義，筆者對耐多藥結核病的診斷方法進展進行綜述，以期為耐多藥結核病的防治提供科學依據。

耐多藥結核病的診斷方法

耐多藥結核病是指結核病患者感染的結核分枝桿菌經體外藥物敏感性試驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥[5]。耐多藥結核分枝桿菌耐藥機制大致可分為3種類型：(1)降低細胞膜的通透性和外排泵機制；(2)產生降解或滅活酶類；(3)改變抗結核藥品作用的靶位[6]。目前，耐多藥結核病的診斷方法主要包括以下幾種。

一、傳統培養基培養方法

耐多藥結核病的成功診斷和治療基于藥物敏感性試驗的結果。藥物敏感性試驗包括通過培養基培養觀察結核分枝桿菌對抗結核藥品的敏感性和檢測結核分枝桿菌相關耐藥基因的分子生物學檢測技術[7]。傳統表型藥物敏感性試驗包括絕對濃度法、比例法、抗性比率法；其中最為常用的是比例法；由于實驗技術的成熟，絕對濃度法使用也較為廣泛，這些方法敏感度高，臨床相關性好[8-9]。固體培養基培養的方法包括世界衛生組織推薦使用的以瓊脂為基質的MiddleBrook 7H10/7H11等方法。由于結核分枝桿菌培養所需的時間較長，獲得藥物敏感性試驗結果需要2～3個月的時間[10]，液體培養基能夠克服其不足，液體培養基的方法即讓結核分枝桿菌在液體培養基中生長，培養基中往往添加促生長因子，能夠為結核分枝桿菌的生長提供充足營養，液體培養基中還加入能夠抑制多種雜菌生長的抗生素。液體培養基主要有手工培養法和自動培養法。手工培養法有MiddleBrook 7H9和Sauton培養基，自動培養法有BACTEC 460、BACTEC MGIT 960、BacT/ALERT3D系統、VersaTrek分枝桿菌液體培養系統，該種類型的培養基能夠提高結核分枝桿菌分離陽性率，減少培養所需時間[11]。其中在液體培養基體系中，最常用的培養基是BACTEC MGIT 960，該培養基的原理是通過檢測二氧化碳的產生和結核分枝桿菌生長指示管氧氣的消耗量來進行耐藥性的檢測[12]。

二、分子藥物敏感性試驗技術

分子藥物敏感性試驗技術的發展克服了傳統表型藥物敏感性試驗所需時間較長的缺點。這些檢測技術可以通過擴增核酸來診斷耐多藥結核病，通過識別特定基因的堿基突變來檢測結核分枝桿菌的耐藥性[13]。這些基因型檢測比表型藥物敏感性試驗更快速和準確。分子藥物敏感性試驗大致可分為：基于探針的檢測技術、基于基因測序技術的檢測方法和其他分子生物學檢測技術。

(一)基于探針的藥物敏感性試驗檢測技術

基于探針的藥物敏感性試驗檢測技術包括線性探針檢測(line probe assays)和GeneXpert MTB/RIF。2008年，世界衛生組織批準了使用線性探針技術用于結核病和耐藥結核病的診斷[14]。2016年，世界衛生組織推薦在培養陽性或痰涂片陽性標本患者中使用線性探針檢測和MTBDRplus技術，用于耐藥結核病以及異煙肼、利福平耐藥性的檢測[15-16]。MTBDRplus技術是一種半自動化的基因型檢測方法，包括DNA提取、多重聚合酶鏈反應(PCR)擴增和反向雜交3個步驟。該方法可以檢測利福平rpoB耐藥基因及異煙肼katG耐藥基因和inhA啟動子區域的突變[17]。Siddiqui等[18]的研究顯示，MTBDRplus對利福平檢測的敏感度為98.8%，對異煙肼檢測的敏感度為90.6%。2018年，世界衛生組織推薦將GenoType MTBDRsl用于耐多藥結核病的診斷，其可以檢測結核分枝桿菌的乙胺丁醇耐藥基因embB突變、氟喹諾酮類藥品的gyrA和gyrB耐藥基因突變和注射類藥品(卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素)的rrs耐藥基因突變[5,19]。2020年，世界衛生組織建議使用GeneXpert MTB/RIF作為成人和兒童肺部和肺外結核耐藥性的初步診斷方法，如對結核性腦膜炎和淋巴結結核的診斷[16]。GeneXpert MTB/RIF是一種基于實時PCR的全自動分子檢測方法，用于檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥性。該檢測方法可在2 h內得到檢測結果。Yasemin等[20]的研究顯示，GeneXpert MTB/RIF的敏感度和特異度分別為92.4%和97.1%。相較于GeneXpert MTB/RIF，GeneXpert MTB/RIF Ultra對于結核分枝桿菌較少的標本，尤其是涂片陰性、培養陽性的標本(主要來源于并發HIV感染的人群)、兒科標本和肺外結核標本(特別是腦脊液標本)，檢測的敏感度增加。Shao等[21]采用GeneXpert MTB/RIF Ultra 對結核性腦膜炎患者的耐藥性進行檢測，敏感度和特異度分別為93%和100%。但GeneXpert MTB/RIF Ultra診斷的準確性還需要更多的研究加以佐證。

(二)其他分子生物學檢測技術

該類檢測技術有聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)，大多數情況下細菌的DNA片段中單一的堿基置換就足以引起單鏈DNA空間構象發生改變。發生的改變能夠導致該單鏈DNA電泳遷移率發生改變。PCR-SSCP的原理正是用電泳的方法將含有突變的DNA片段與正常的DNA片段比較后進行區分。Ali等[22]通過PCR-SSCP檢測結核分枝桿菌耐藥基因(katG、rpoB)的突變，對了解結核分枝桿菌對異煙肼、利福平的耐藥狀況具有重要意義。Choi等[23]的研究顯示，異煙肼、利福平和環丙沙星的耐藥性與katG、rpoB和gyrA基因突變有關，通過PCR-SSCP檢測結核分枝桿菌臨床分離株的katG、rpoB和gyrA耐藥基因，并且分析臨床耐藥情況，對指導結核病的治療具有重要意義。PCR-SSCP技術操作簡單，檢測所需時間較短，對于設備和試劑無特殊要求，無放射性污染，技術條件成熟，檢出率相對較高，使用廣泛，但也會受到待測DNA片段長度、聚丙烯酰胺的濃度、緩沖液的離子強度及電泳時的溫度等因素的影響，限制了該方法的實際應用，并且PCR-SSCP無法給出突變位點的具體位置和突變性質，故只能用于基因突變的篩選[24-25]。

(三)基因測序技術

1.DNA直接測序法：細菌基因組DNA直接測序法利用PCR擴增需要測量的基因序列，將DNA片段直接進行測序，用測得的堿基序列與標準株的同一段DNA片段進行比較，尋找堿基突變的位置和突變類型，目前DNA直接測序法是檢測細菌基因突變所使用的標準[26-27]。Cole等[28]于1998年首次對結核分枝桿菌的基因序列進行了全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)，得到了結核分枝桿菌全基因組的堿基組成數量及其所包含的基因數量，并且發現了結核分枝桿菌的遺傳物質與其他細菌的區別，發現了可能導致其發生抗原變異的遺傳物質機理。Roa等[29]通過對臨床與實驗室分離的結核分枝桿菌進行WGS，并與H37Rv標準株進行比較，發現了基因中很多與異煙肼、利福平、鏈霉素等抗結核藥品相關的堿基突變。

2.二代基因測序法：二代基因測序法(next generation gene sequencing，NGS)又稱高通量測序(high through put sequencing)，是世界衛生組織推薦的用于快速診斷結核病的方法，能夠在減少患者耐藥治療延誤的基礎上診斷耐藥結核病。目前的WGS不能完全區分低耐藥性和高耐藥性的突變，或者與耐藥性無關的一些突變[30-31]。由于在臨床分離株中進行WGS存在需要做結核分枝桿菌培養以產生足夠菌量的缺點，相比之下，靶向NGS可以直接對臨床分離株樣本進行測序，該方法可快速運用患者痰液標本進行耐多藥檢測[32-33]。因此，NGS可以為所有臨床相關耐藥突變提供深入而全面的數據，可替代目前診斷耐多藥結核病的表型診斷方法和分子藥物敏感性試驗診斷方法。

NGS目前有3種類型。分別是Illumina、Roche 454和ABI-SoliD reprint[34-36]。目前已有許多關于使用NGS對結核分枝桿菌藥物敏感性試驗進行研究的報道。Ko等[37]將NGS應用于結核分枝桿菌耐藥基因分析，得到耐藥基因堿基突變情況列表，為今后使用NGS進行結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的研究提供了參考。Coll等[26]通過對中國、巴基斯坦、馬拉維等國的792株結核分枝桿菌基因組表型數據進行分析，編制了一個能預測15種抗結核藥品耐藥性且包括1325個突變的數據庫，并對其中包括異煙肼、利福平、鏈霉素在內的11種抗結核藥品的耐藥性進行了驗證，建立了一種快速在線“TB-Profiler”分析器，能夠直接從原始序列報告結核病耐藥性和基因突變類型的分布圖。NGS由于具有通量大、檢測時間短、精確度高、信息量豐富等優點，被臨床廣泛應用于耐藥結核病，特別是耐多藥結核病的檢測。

總 結

作為全球重大的公共衛生問題，耐多藥結核病的防治對于結核病的防治具有重要意義。因此，對于耐多藥結核病的檢測顯得尤為重要。對于結核病患者，如診斷后不進行耐藥檢測就盲目使用抗結核藥品，容易使患者產生耐藥和導致治療失敗。分子藥物敏感性試驗技術應用于耐藥結核病的診斷已得到快速發展。NGS用于耐藥結核病的診斷時能夠直接從臨床樣本中提取DNA進行檢測，可減少指導臨床用藥時間，并能夠對菌株的毒力與進化譜系進行分析，對研究耐多藥結核病的致病機制和傳播機制具有重要意義，同時使患者能夠盡早接受耐藥治療，降低疾病傳播的風險，對結核病的防治具有重要意義。