外泌體改善心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究進展

李 勝，李 瀾，郭 蕊，樊官偉，2

外泌體是直徑為30～100 nm并具有脂質雙層膜結構的細胞外囊泡。1981年，Trams 等[1]在體外培養的綿羊紅細胞上清液中發現了有膜結構的小囊泡，并命名為外泌體。當時推測外泌體的作用為細胞排泄廢物的一種方式。隨著外泌體的研究日益增多，研究者發現其在機體免疫應答、細胞分化、抗原呈遞、腫瘤發生發展等各種生物過程中起作用[2]。目前的主流觀點認為，外泌體的形成過程為：細胞膜內陷，形成內體，再形成多泡體，最后分泌到胞外成為外泌體。幾乎所有類型的細胞都能分泌外泌體，同時外泌體也廣含核酸[microRNA(miRNA)、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等]、蛋白質、脂質等，其表面標志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2 互作蛋白 X(Alix)、腫瘤易感基因 101(TSG101)、熱休克蛋白27(HSP27)等。目前對于外泌體的鑒定主要有4種方法：透射電子顯微鏡、Nanosight、免疫印跡、流式細胞術[3]。關于外泌體的分離方法主要有基于差速離心的分離技術、基于大小的分離技術、基于免疫吸附的分離技術、沉淀法、基于微流控的分離技術[4]。

1 心肌缺血再灌注損傷機制

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球死亡和致殘的主要病因，經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)應用于ST段抬高型心肌梗死病人所表現出的缺血性損傷是及時而有效的，但心肌再灌注本身可能進一步導致心肌細胞死亡故而加重心肌損傷，這種現象稱為心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)損傷[5]，因此，再灌注被描述為“雙刃劍”[6]。MIR損傷是心血管疾病病理學的核心，由多種因素介導，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增加，尤其是在再灌注過程中，造成氧化應激損傷，而還原酶Ⅱ(NADPH)氧化酶同源物家族的線粒體呼吸鏈和NADPH氧化酶是心肌細胞中活性氧的主要來源[7]。細胞凋亡也可導致MIR損傷，但可能是通過對非心肌細胞的作用引起的，通過凋亡和壞死引起的心肌細胞死亡也是心力衰竭發病機制中的重要組成部分，并由死亡受體和線粒體信號傳導介導[8]。另外，在MIR后的缺血期，局部缺血抑制脯氨酰羥化酶活性導致細胞缺氧和炎癥信號級聯反應的翻譯后激活，控制缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)和核轉錄因子-κB(NF-κB)的穩定性增加血管通透性、引發炎癥反應，再灌注期間補體系統激活，白細胞與內皮細胞之間的黏附和血小板與白細胞的聚集加重了微血管功能障礙[9]。

2 外泌體的功能

細胞間的通訊是各種生理和病理過程所必需的，累積的證據表明細胞除了釋放可溶性因子外，還可以通過外泌體進行通信[10]。外泌體作為細胞間通訊的信使在細胞之間傳遞各種信號分子，尤其是蛋白質、mRNA和非編碼RNA，其中最值得注意的是miRNA。Valadi等[11]報道miRNA可以通過外泌體在細胞之間轉移，細胞釋放的外泌體中miRNA與相關媒介共同循環到達鄰近細胞和遠處的細胞，miRNA被遞送至受體細胞后發揮功能性作用，盡管不能完全排除其他外泌體內容物對受體細胞的影響，但miRNA被認為是外泌體中關鍵的功能元件。近年來，外泌體作為多種細胞[如心臟祖細胞、間充質干細胞、內皮細胞、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)等]的旁分泌因子成為各種疾病模型的研究熱點，并被認為是再生醫學中最有希望的治療策略之一[12]。文獻證實外泌體作用于心肌MIR損傷模型具有抗氧化應激、抗心肌細胞凋亡、抗炎、促血管新生以及修復心肌損傷等功能[13-17]。外泌體改善MIR損傷的機制如下。

2.1 抗氧化應激 有研究表明，再灌注損傷的關鍵特征為三磷酸腺苷(ATP)/NADH的喪失、氧化應激的增加和細胞死亡，這是由缺血再灌注心肌的蛋白質組學缺陷所導致[15]。脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSC)外泌體通過補充MIR損傷丟失的氧化磷酸化途徑中的關鍵酶來恢復生物能以減少氧化應激誘導的心肌細胞凋亡[18]。間充質干細胞外泌體可增加ATP水平，減少氧化應激并激活PI3K/Akt途徑以增強心肌活力防止MIR后的心臟重塑[19]。誘導多能干細胞外泌體/微囊泡通過受Nanog和缺氧誘導因子-1α調控的miR-21和miR-210抑制Caspase 3/Caspase 7的激活，從而保護H9C2細胞免受H2O2誘導的氧化應激[20]。由此可見，外泌體通過升高ATP水平、抑制凋亡途徑從而減少MIR的氧化應激反應。

2.2 抗心肌細胞凋亡 間充質干細胞來源的外泌體增強心肌細胞H9C2缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型的細胞活力，降低細胞凋亡和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平，降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比例并增加p62的表達，從而抑制自噬并上調離體大鼠MIR模型的Bcl-2和mTORC1/p-4eBP1信號通路，下調Traf6減少MI/R誘導的細胞凋亡和自噬[21]。Wang等[22]采用H2O2和CoCl2處理新生大鼠心肌細胞模擬體內MIR損傷誘導的細胞凋亡并建立大鼠MIR模型，結果顯示外泌體攜帶miR-126靶向ERRFI1減少細胞凋亡和活性氧的積累從而改善心功能。遠程缺血預處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)誘導的大鼠血漿外泌體可以通過旁分泌方式轉移miR-24下調H2O2處理的H9C2細胞表達，減少大鼠MIR模型中心肌細胞的凋亡，縮小梗死面積并改善心臟功能[23]。Cui等[24]研究發現ADMSC可能通過激活Wnt/-catenin信號通路拮抗MIR和H/R誘導的心肌細胞凋亡。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)外泌體調控miR-486-5p激活PI3K/Akt信號通路抑制H/R模型和MIR模型中受損心肌細胞的凋亡[16]。另有實驗研究證實，骨髓間充質干細胞外泌體攜帶miR-125b靶向SIRT7下調Bax、Caspase-3凋亡相關蛋白和白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)炎性因子水平，并上調Bcl-2表達，以減輕MIR大鼠心肌組織的病理損傷[25]。因此，外泌體大多通過抑制凋亡級聯反應保護心肌細胞而改善心臟功能。

2.3 抑制炎癥反應 大鼠M2型巨噬細胞外泌體攜帶miR-148a下調硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達并使Toll樣受體4 (TLR4)/NF-κB/NLRP3炎性體信號通路失活以減輕MIR損傷[26]。間充質干細胞外泌體調控miR-182靶向TLR4/PI3K /Akt/信號通路促進巨噬細胞的M2型極化，從而減輕炎癥反應、緩解心肌MIR損傷[13]。另有實驗表明，間充質干細胞外泌體傳遞的miR-181a可能通過c-Fos抑制炎癥反應并促進Treg細胞的極化保護MIR損傷后的心臟[27]。ADMSC靶向PI3K/Akt/GSK3β、pm-TOR/p-AMKP和NF-κB信號通路抑制內在細胞應激反應和炎癥保護心臟免受MIR損傷[28]。此外，從大鼠和健康志愿者中分離和表征血漿外泌體并用于離體，體內和體外MIR或H/R模型驗證了血漿外泌體通過熱休克蛋白70(HSP70)/TLR4信號通路介導的心臟保護作用[29]。綜上所述，外泌體主要通過TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信號途徑抑制MIR后的炎癥反應。

2.4 促血管新生 血管生成在包括傷口愈合和組織修復在內的各種生理過程中起著至關重要的作用，依靠內皮細胞與其周圍環境之間的緊密相互作用[10]。蛋白組學分析結果表明，間充質干細胞衍生的外泌體包含血管生成旁分泌效應子，NF-κB信號傳導被確定為間充質干細胞外泌體誘導的內皮細胞血管生成的關鍵介質，在治療缺血性組織相關疾病方面具有很大潛力[17]。Vandergriff等[30]使用心臟歸巢肽(cardiac homing peptide，CHP)與心肌干細胞來源外泌體結合將外泌體靶向梗死心臟部位增加血管性血友病因子(vWF)的表達促進血管新生，減少瘢痕大小促進心臟修復。研究表明，在小鼠MIR損傷模型中將心臟祖細胞衍生的外泌體直接注射到小鼠心臟中可抑制心肌細胞凋亡，并進一步證實源自NADPH氧化酶的活性氧可以增強內皮細胞中的血管生成[31]，這可能是治療缺血性心血管疾病的有效治療策略。

2.5 修復心肌損傷 間充質干細胞通過旁分泌機制分泌外泌體減小MIR損傷的離體小鼠Langendorff心臟模型的梗死面積發揮對心臟的修復作用[32]。De Couto等[33]研究發現，心肌球來源細胞(cardiomy-ocyte derived cells，CDC)外泌體miR-181b轉移到M?中降低PKCδ轉錄水平并改變M?的極化狀態，縮小大鼠和豬MI/R模型的梗死面積從而保護心臟。急性心肌梗死和恢復期心肌梗死豬模型中CDC外泌體經心肌原位注射作用于豬MIR損傷模型能減少瘢痕形成，改善心臟不良重塑并縮小梗死面積[34]。Agarwal等[26]評估新生兒心臟祖細胞外泌體促進MIR損傷后的血管生成，減少纖維化和心肌肥大，修復心肌組織從而改善心臟功能；此外，研究表明，全身性使用CXCR4過表達的心臟祖細胞外泌體可縮小MIR大鼠梗死面積并提高左室射血分數，從而修復心肌損傷。

3 臨床研究

Zhang等[35]對外泌體治療MIR損傷的臨床效果進行薈萃分析，根據危險區域占左心室的百分比、梗死面積占危險區域的百分數、梗死面積占左心室的百分比、左心室射血分數、左心室縮短分數、舒張末期容積和收縮末期容積評估外泌體對心臟功能的影響，其分析表明，目前可獲得的數據證實了間充質干細胞分泌的外泌體在改善心臟功能方面的治療潛力，但對于MIR損傷后這種心臟再生方法的優化和驗證，還需要進一步的機制研究、治療安全性的評估和臨床試驗的開展。

4 總結與展望

在心肌MIR損傷中外泌體通過抗氧化應激、減少心肌細胞凋亡、抑制炎癥反應、促進血管新生、修復心肌損傷等作用來改善心臟功能。因此，外泌體對MIR損傷表現出可觀的治療潛力。外泌體作為藥物遞送載體在細胞間遞送蛋白質和核酸等生物活性物質，實現了跨越不同生物屏障將藥物有效遞送至靶細胞的有效治療策略，但是在將外泌體成功轉化為臨床實踐之前需要克服許多不可避免的障礙，深入研究外泌體作為藥物載體的可靠療效，針對包括MIR在內的多種疾病的作用靶點以及優化的分離方法為新興的“無細胞”替代療法提供有益探索。