動脈粥樣硬化的生物治療研究進展

洪詩卉，伍 鋒，樊 民

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，盡管多年以來在動脈粥樣硬化的預防和治療領域已經(jīng)有許多深入的研究，但其仍是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因[1]。當前治療動脈粥樣硬化的主流策略是采用他汀類藥物治療，但其常引起肝損傷、肌痛等不良反應，且強化降脂治療后仍存在較高的殘余風險[2-3]。因此，單純他汀類藥物已無法滿足所有需求，需要尋找更有針對性的治療策略。隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，動脈粥樣硬化的生物治療得到深入的發(fā)展，效果顯著，安全性好[4]。生物治療包括細胞治療和非細胞治療，其中非細胞治療又分為抗體、疫苗、基因修飾等內(nèi)容。

1 細胞治療

1.1 基于組織修復和血管新生的干細胞治療 近年來，干細胞技術(shù)作為第3種醫(yī)療手段，為許多“頑疾”帶去了治療的希望，而其與動脈粥樣硬化對抗的表現(xiàn)也毫不遜色，展現(xiàn)了干細胞用于動脈粥樣硬化的巨大潛力[5]。干細胞治療的主要作用機制是改善自我修復、促進血管新生。近年的研究多采用間充質(zhì)干細胞(MSCs)、內(nèi)皮祖細胞(EPCs)、脂肪源性干細胞(ADSCs)等作為種子細胞，回輸?shù)絼用}粥樣硬化誘發(fā)的缺血部位，通過旁分泌作用刺激組織自我修復和血管新生。

1.1.1 MSCs MSCs是多能細胞的一種亞群，幾乎可以從所有的人體器官和組織中分離出來，具有再生、多向分化和免疫調(diào)節(jié)特性，被認為是目前最有潛力的動脈粥樣硬化替代治療方法之一。MSCs在炎癥等環(huán)境的刺激下通過分泌多種可溶性小分子物質(zhì)、囊泡結(jié)構(gòu)物質(zhì)等旁分泌作用靶向EPCs、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞、T細胞等參與炎癥反應、免疫作用調(diào)節(jié)，進而發(fā)揮動脈粥樣硬化保護作用。近年來，有研究表明MSCs亦可通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)來改善棕櫚酸(PA)誘導的內(nèi)皮脂肪毒性，抑制內(nèi)皮功能障礙[6]，抑制巨噬細胞焦死穩(wěn)定斑塊等機制起作用。相比單純骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)或BM-MSCs+順式-9、trans-11，ADSCs更適合移植治療動脈粥樣硬化[7]。

1.1.2 EPCs EPCs是一類具有高增殖潛能的前體細胞。在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，存在修復損傷內(nèi)皮的EPCs耗竭，即EPCs依賴性的動脈修復缺乏。pCMV6介導的二甲基精氨酸二甲基氨基氫化酶(DDAH2)基因過表達可以促進EPCs歸巢，提高分化內(nèi)皮的完整性[8]。過表達骨鈣素的EPCs分泌的外泌體促進內(nèi)皮細胞增殖、EPCs遷移和血管形成[9]。有研究表明，EPCs不但可以分化為內(nèi)皮細胞，還可以轉(zhuǎn)分化為平滑肌祖細胞，再分化為平滑肌細胞，參與斑塊的形成[9]。盡管如此，研究者仍有理由推測，動員內(nèi)源性EPCs或補充外源性EPCs可能是防治動脈粥樣硬化的有效措施。

1.1.3 ADSCs 脂肪組織來源的間質(zhì)細胞被認為是一種潛在的對心血管修復有用的干細胞來源。大量研究顯示，ADSCs主要位于機體血管外周，且具有分化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等血管細胞的潛能，在血管發(fā)生和血管生成過程中起重要作用。鑒于此，很多學者把其看作是特定的血管干細胞(vascular stem cells，VSCs)[10]。EPCs在血管受損后，“遠水難救近火”，然而位于血管外周的脂肪組織中有大量的ADSCs，且ADSCs具有取材方便、創(chuàng)傷小、來源充足以及良好的免疫獲免性等優(yōu)勢，具有更顯著、更全面、更有效的血管新生潛能，其可以通過分化為內(nèi)皮系細胞、旁分泌干細胞生長因子、基質(zhì)衍生因子-1、血管內(nèi)皮生長因子等細胞因子促進血管形成[11]。

然而干細胞治療動脈粥樣硬化仍存在較多難題尚未解決，如干細胞移植后存活率低，趨向性較差，只有不到1%的移植細胞真正到達了靶組織，大部分移植細胞被困在肝、脾和肺，即使是歸巢并移植到梗死區(qū)的干細胞也沒有表現(xiàn)出任何證據(jù)表明其轉(zhuǎn)化為新的心肌細胞。因此，仍需要大量的研究進一步解決。

1.2 基于調(diào)節(jié)炎癥的細胞治療

1.2.1 巨噬細胞 近年來，研究表明巨噬細胞在動脈粥樣硬化的進展中起關鍵作用，斑塊內(nèi)微環(huán)境因素的刺激下，表現(xiàn)出不同的極化狀態(tài)，即具有促炎作用的M1型；具有抗炎作用的M2型(M2型巨噬細胞能縮小斑塊，增強斑塊穩(wěn)定性)；能促進氧化應激的MHEM型；具有雙重作用的M4型；作用于動脈粥樣硬化進展而產(chǎn)生的磷脂Mox型。促進巨噬細胞向M2極化可在動脈粥樣硬化進展中呈現(xiàn)保護作用，這可能與RhoA通路有關，如西紅花苷、姜黃素、人參皂苷Rg3等中藥成分，以及一些已被臨床證實用于治療其他疾病的藥物也被發(fā)現(xiàn)通過該通路起抗動脈粥樣硬化的作用，如西格列汀、利拉魯肽、二甲雙胍等[12]，抗炎基因蛋白酪氨酸磷酸酶非受體2型(PTPN2)[13]、心肌蛋白相關轉(zhuǎn)錄因子A(MRTF-A)[14]等可以調(diào)控該通路。

1.2.2 B細胞 B細胞具有抗動脈粥樣硬化和促動脈粥樣硬化的雙重功能，這與其B細胞亞群的屬性有關。B1細胞和邊緣區(qū)B細胞被認為對動脈粥樣硬化有保護作用，而毛囊B細胞和天然反應激活劑B細胞被證明促進動脈粥樣硬化。B細胞通過抗體產(chǎn)生、細胞因子釋放和抗原呈遞以及B細胞獨特的適應高脂血癥和炎癥環(huán)境的方式參與動脈粥樣硬化的進展。近年來，靶向B細胞作用于動脈粥樣硬化效果顯著。

1.2.3 T細胞 研究表明Th1細胞、CD4+CD28-T細胞和自然殺傷性T細胞(NKT細胞)具有促動脈粥樣作用，而Th2細胞和調(diào)節(jié)T細胞(Treg細胞)具有動脈粥樣保護作用[15]；CD8+T細胞浸潤已被鑒定為小鼠和人類動脈粥樣硬化的特征，在動脈粥樣硬化早期，CD8+T細胞促進巨噬細胞聚集，發(fā)揮細胞毒作用，促進巨噬細胞死亡，形成壞死核心。抗體介導的CD8+T細胞耗損可以改善動脈粥樣硬化[16]。T細胞的關鍵調(diào)節(jié)劑半乳凝素-9(Gal-9)通過清除促炎T細胞，增加Treg細胞的數(shù)量，促進巨噬細胞向M2極化等機制發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[17]。B細胞和CD4+T細胞利用細胞表面主要組織相容性Ⅱ型抗原(MHCⅡ)和CD40相互作用促進高脂小鼠動脈粥樣硬化，因此，靶向B細胞和CD4+T細胞相互作用可能是限制動脈粥樣硬化進展的治療策略[18]。

1.2.4 樹突狀細胞(dendritic cell，DC) 樹突狀細胞的成熟有助于動脈粥樣硬化的發(fā)展。白細胞介素-37(IL-37)通過白細胞介素-1受體8(IL-1R8)-Toll樣受體4(TLR4)-核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路抑制樹突狀細胞成熟，減輕ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化[19]。樹突狀細胞自噬破壞誘導一種反調(diào)節(jié)反應，維持高脂飲食下低密度脂蛋白(LDL)受體基因敲除(LDLR-/-)小鼠的免疫穩(wěn)態(tài)，并限制動脈粥樣硬化發(fā)生。在樹突狀細胞中選擇性調(diào)節(jié)自噬可能是一個有效的治療靶點[20]。

1.2.5 血小板 血小板除了止血功能外，還參與了動脈粥樣硬化的早期過程，通過分泌大量趨化因子，包括CXC趨化因子配體(CXCL)4或血小板因子4(PF4)、趨化因子配體L5(CCL5)、CXCL12或基質(zhì)細胞衍生因子-1 α(SDF-1 α)、CXCL16等啟動或促進血管損傷部位的局部炎癥過程[21]；誘導巨噬細胞中的細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(SOCS3)通過促進巨噬細胞偏向M1炎性表型[22]等途徑參與動脈粥樣硬化進展。因此，血小板應該仍然是一級預防方法的主要靶點。當前研究表明可以靶向Bcl-xL促進血小板凋亡，選擇性減少循環(huán)血小板，從而降低糖尿病病人動脈粥樣硬化和心血管疾病風險[23]。

2 非細胞治療

2.1 抗體

2.1.1 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)相關單克隆抗體

2.1.1.1 依洛尤單抗 2018年7月31日，中國國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準依洛尤單抗(Evolocumab，瑞百安?/Repatha?)可在國內(nèi)獲批用于治療成人或12歲以上青少年純合子型家族性高膽固醇血癥(HoFH)；2019年1月24日，安進公司(Amgen)宣布NMPA批準其新的適應證，用于成人動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的治療，以降低心肌梗死、腦卒中和冠狀動脈血運重建的風險。Evolocumab成為首個獲得ASCVD適應證的PCSK9抑制劑。Evolocumab已被證明可有效降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，并進一步降低心肌梗死和腦卒中風險。FOURIER研究納入25 096例病人，中位隨訪2.2年，與他汀類+安慰劑組相比，他汀類+Evolocumab組脂蛋白(a)[Lp(a)]降低26.9%，心肌梗死風險降低27.0%，腦卒中風險降低21.0%，冠狀動脈血運重建風險降低22.0%；FOURIER研究亞組分析結(jié)果顯示，Evolocumab在亞洲人群中降低心血管事件的有效性和安全性與非亞洲人群一致[24]。但也有研究表明，盡管服用Evolocumab后可明顯降低LDL-C，但存在動脈壁持續(xù)炎癥[25]。

2.1.1.2 Alirocumab Alirocumab是人類單克隆抗體的IgG1型，也是PCSK9抑制劑。在皮下給予Alirocumab后，游離PCSK9的最大抑制發(fā)生在4～8 h內(nèi)，并且具有17～20 d的表觀半衰期。抑制是劑量依賴性的，抗體通過循環(huán)分布，并通過與其靶標結(jié)合以低濃度消除，并通過蛋白水解途徑以較高濃度消除[26]。在對18 924例心血管疾病病人平均隨訪2.8年后發(fā)現(xiàn)，使用Alirocumab治療后明顯降低主要心血管不良事件和死亡率[27]。在既往有急性冠脈綜合征并接受高強度他汀類藥物治療的病人中，接受Alirocumab的病人復發(fā)缺血性心血管事件的風險比接受安慰劑的病人低[15]。

2.1.2 血管生成素樣蛋白3(Angptl3)單抗 Evinacumab是Angptl3的抑制劑。治療24周后LDL-C下降47.1%，膽固醇下降43.4%，載脂蛋白B、非高密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和總膽固醇水平也顯著降低，并且該抗體治療總體耐受性良好，最常見的不良反應是流感樣疾病，但也僅有11%接受Evinacumab治療的病人出現(xiàn)該反應[28]。目前，食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準其作為結(jié)合子型家族性高膽固醇血癥(HoFH)病人的輔助用藥。

2.1.3 白細胞介素-1(IL-1)相關單克隆抗體 IL-1能夠特異性地促進血管粥樣硬化斑塊的形成、生長和破裂，這是缺血性心血管并發(fā)癥的原因[29-30]。白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-1α(IL-1α)在動脈粥樣硬化病變中均高表達，并通過誘導內(nèi)皮細胞表達黏附分子促進白細胞募集[31]；臨床實驗證據(jù)表明，這些效應可以被IL-1β抑制劑逆轉(zhuǎn)，因此，選擇性藥物封鎖是抑制動脈粥樣硬化病變進展的合適治療策略[30]。

2.1.3.1 Canakinumab Canakinumab是一種靶向IL-1β的單克隆抗體，CANTOS研究表明，每3個月150 mg的Canakinumab可明顯降低心血管事件的復發(fā)率及血脂水平[31]，該結(jié)果是通過白細胞介素-6(IL-6)信號通路介導的[32]。一項對CANTOS研究的二次分析表明，采用Canakinumab治療的病人中，相較于超敏C反應蛋白(hs-CRP)濃度≥2 mg/L的病人，hs-CRP<2 mg/L的病人主要心血管不良事件減少了25%，心血管死亡率和全因死亡率都降低了31%[33]。

2.1.3.2 Anakinra Anakinra是IL-1受體拮抗劑(IL-1Rα)，可以阻止IL-1α和IL-1β與白介素1受體Ⅰ(IL-1R1)的結(jié)合[34]。Anakinra可以降低膽固醇，這可能與骨髓和脾臟中的單核細胞增多有關；增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，這與脾髓外骨髓生成減少引起的循環(huán)單核細胞減少有關[35]。CANTOS研究顯示了一種潛在的危險，Canakinumab的使用增加了機會性感染的風險，但概率很小。

2.1.3.3 Rilonacept Rilonacept是一種皮下注射的可溶性融合蛋白，由IL-1R1胞外部分的配體結(jié)合域，和IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)呈線性連接至人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc結(jié)合域。通過充當一種可與IL-1α和IL-1β結(jié)合的受體來抑制IL-1的信號傳導，從而阻斷其與細胞表面IL-1受體相互作用。Rilonacept的Ⅱ期臨床試驗中取得積極結(jié)果，試驗結(jié)果顯示，在6個月的治療期間，與病人的自然病史相比，接受Rilonacept治療病人的心包炎發(fā)生率從每年3.9次降至低于每年0.18次[36]。此外，Rilonacept可明顯降低C反應蛋白(CRP)水平，從而改善動脈粥樣硬化病人動脈功能。也有試驗表明，抗IL-1藥物可能由于反彈現(xiàn)象而使不良事件發(fā)生風險增加，但這是基于對少數(shù)事件的事后分析，并沒有得到所有其他相關試驗的支持。此外，成本問題也限制了這些治療策略在臨床的實際應用。

2.1.4 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體單抗 NLRP3是由細胞內(nèi)模式識別受體(PRR)誘導的多種蛋白組成的復合體，能促進細胞因子IL-1β、白細胞介素-18(IL-18)的前體分泌和成熟[37]。

2.1.5 IgM E06單抗 IgM E06是以氧化磷脂(OxPL)的磷酸膽堿頭基團為抗原的天然抗體，研究表明IgM E06可以使動脈粥樣硬化病變發(fā)生率減少。主動脈瓣超聲心動圖和組織學檢查顯示，IgM E06可以減少了主動脈瓣鈣化，降低腹膜巨噬細胞中膽固醇的積累和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的體內(nèi)攝取，腹膜和主動脈巨噬細胞的炎癥表型均減少。血清淀粉樣蛋白A降低32%，提示全身炎癥減輕。IgM E06有助于減少全身炎癥，延緩動脈粥樣硬化、主動脈狹窄的進展[38]。

2.1.6 CD抗體 CD3-Ab治療通過減少CD4+T細胞和增加Treg細胞的比例誘導動脈粥樣硬化的快速消退[39]。研究表明，動脈粥樣硬化的形成與CD47的上調(diào)有關，CD47封閉抗體可以使病變血管組織的清除正常化，并改善多只小鼠的動脈粥樣硬化[40]。

2.2 疫苗 動脈粥樣硬化過程存在自身免疫成分，可通過免疫方法(包括接種疫苗)進行調(diào)控。因疫苗具有抗原特異性，可以靶向提供長期治療，并對機體產(chǎn)生較少的副反應。

2.2.1 針對PCSK9的疫苗

2.2.1.1 PCSK9Qβ -003 PCSK9Qβ -003是一種靶向PCSK9的治療性疫苗，該疫苗能明顯降低ApoE-/-小鼠的總膽固醇和LDL-C，減小斑塊大小，增加斑塊穩(wěn)定性，降低巨噬細胞的浸潤、單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子-α的表達，減少ApoE-/-小鼠主動脈病變區(qū)細胞凋亡，其機制為PCSK9Qβ -003上調(diào)肝臟X受體和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1的表達水平[41]。

2.2.1.2 抑制PCSK9的多肽疫苗 該疫苗由短肽結(jié)合鎖眼帽貝血青素(KLH)作為載體蛋白組成。在ApoE-/-小鼠中加入佐劑接種疫苗，可顯著誘導抗PCSK9抗體反應，血漿總膽固醇、極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)水平持續(xù)下降達24周，免疫小鼠細胞表面LDL受體表達顯著增加。用KLH而非PCSK9作用于ApoE-/-小鼠，可以誘導γ干擾素(INF-γ)和白細胞介素-4(IL-4)的產(chǎn)生[42]。

2.2.1.3 與米脂質(zhì)體結(jié)合的PCSK9-tetanus融合的免疫原性肽(L-IFPTA+) 該疫苗為免疫原性融合PCSK9-tetanus的免疫原性肽使用DSPE-PEG-馬來酰亞胺脂質(zhì)(L-IFPT)在納米脂質(zhì)體表面結(jié)合，并吸附到水凝膠(R)上而形成的一種疫苗，在嚴重動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)產(chǎn)生長效、功能性、安全的PCSK9特異性抗體，并對高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化具有長期治療作用[43]。

2.2.2 血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)疫苗 ATRQβ001疫苗是針對AT1R中的肽ATR001。ATRQβ001疫苗可以誘導抗ATR001單克隆抗體(McAb-ATR)的產(chǎn)生，并在沒有反饋性激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的情況下，通過調(diào)節(jié)β -arrestin2抑制動脈粥樣硬化[44]。

2.3 基因修飾 特異性沉默PCSK9 mRNA Inclisiran是特異性沉默PCSK9 mRNA的小干擾RNA(siRNA)，使PCSK9蛋白表達減少，從而減少LDL-C受體降解，增強肝細胞對LDL-C的清除能力，使LDL-C水平降低。ORION-1研究結(jié)果表明， Inclisiran使LDL-C降低52.6%，接近使用PCSK-9抗體的療效。ORION-10和ORION-11研究結(jié)果表明，Inclisiran分別使LDL-C降低52.3%和49.9%，且不良事件發(fā)生率低(分別為2.6%和4.7%)[45-46]。ORION-4結(jié)果尚待公布[47]，計劃隨訪5年。EMA的人用藥品委員會(CHMP)建議Inlisiran用于治療患有高膽固醇血癥或混合性血脂異常的成年人，可能批準該藥上市。特異性修飾載脂蛋白C3(ApoC3) mRNA Volanesorsen是一種與ApoC3 mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸，可使ApoC3降解，抑制三酰甘油(TG)代謝和乳糜粒在肝臟的清除。Volanesorsen的Ⅰ期臨床試驗表明，其可使TG降低75%， LDL-C降低25%，HDL-C升高75%；Ⅱ期臨床試驗表明，TG降低62%，極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)降低60%，HDL-C升高42%[48]。Ⅲ期臨床試驗表明，3個月后ApoC3平均下降84%，6個月后ApoC3下降83%，TG下降77%[49]。COMPASS試驗表明，Volanesorsen可使空腹TG≥500 mg/dL(5.65 mmol/L)的病人胰腺炎的發(fā)病率顯著降低[50]。目前，Volanesorsen已獲得美國FDA的“條件授權(quán)”，用于胰腺炎的高危病人以及其他藥物和低脂飲食均治療不佳的病人。

特異性修飾Lp(a) mRNA Pelacarsen(TQJ230)是特異性進入肝臟抑制Lp(a)mRNA的反義寡核苷酸(ASO)，可以降低Lp(a)水平。Ⅱ期臨床試驗表明，每周20 mg的Pelacarsen能使Lp(a)降低35%～80%。2020年開始的Ⅲ期臨床試驗目前正在進行中，預計在2024年明確伴隨Lp(a)大幅度下降是否會帶來心血管事件的減少[51]。

3 其他生物治療方案

也有研究者采用外泌體(Exosomes)制備富含miRNA的藥物投遞系統(tǒng)等方式治療動脈粥樣硬化相關性疾病。有研究顯示，M2巨噬細胞來源的外泌體(M2 Exo)具有抗炎性和抗炎能力，該特性通過其表面結(jié)合趨化因子受體和抗炎M2巨噬細胞釋放的細胞因子實現(xiàn)[52]。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型中紡錘形脂肪細胞產(chǎn)生的外泌體抑制miR-342-5p表達從而保護內(nèi)皮細胞損傷，防止動脈粥樣硬化[53]。自MSCs的外泌體可通過miR-let7/高遷移率族蛋白A2(HMGA2)/NF-κB通路改善ApoE-/-小鼠中的動脈粥樣硬化，能夠遷移到動脈粥樣硬化斑塊，并選擇性地在巨噬細胞附近定居，降低了ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積，并大大減少了斑塊中巨噬細胞的浸潤，誘導巨噬細胞向M2極化[54]。MSCs衍生的富含miR-145的外泌體可以有效地將miR-145從MSCs傳遞到人臍靜脈內(nèi)皮細胞，下調(diào)其靶向基因JAM-A，抑制體內(nèi)遷移，減少體內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊[55]。從MSCs來源的細胞外囊泡轉(zhuǎn)移microRNA-221可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[56]。

4 小 結(jié)

以動脈粥樣硬化為病理基礎的動脈粥樣硬化性心血管疾病是嚴重危害人類健康的最主要疾病，在我國的發(fā)病率逐年上升并有年輕化趨勢，其死亡人數(shù)已占總死亡人數(shù)的35%～40%。每年用于治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的費用在千億元以上。雖然目前綜合藥物和介入、搭橋等治療有效降低了此類病人的急性期死亡率，但對病人的長期預后改善仍較有限。隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，生物治療為動脈粥樣硬化相關性疾病治療帶來更優(yōu)化的效果、更安全性的策略。也有學者認為21世紀將是生物治療的時代。然而，細胞治療與非細胞治療仍然存在很多局限性，限制其臨床轉(zhuǎn)化。需要更加深入的基礎研究以及大樣本、多中心的臨床研究來進一步明確其有效性和安全性。