基于Notch信號通路探討中醫藥干預缺血性腦卒中的研究進展

周劍英，何思錦，顧力華，謝 青

缺血性腦卒中是由多種因素誘發腦組織局部血流灌注減少或完全中斷，導致神經細胞處于缺氧缺血狀態的神經內科常見疾病類型，病人主要臨床表現為不同程度的神經功能損傷，如失語、偏癱等[1]。流行病學報道顯示，我國缺血性腦卒中發病率為2萬～3萬，而致死致殘率為30%～40 %，病人出院后常合并肢體運動功能障礙，在影響自身工作生活質量的同時，亦給家庭和社會帶來極大負擔[2]。針對神經再生是缺血性腦卒中具有神經功能恢復的難點及核心問題，通過Notch信號通路，調節具有自我更新能力的神經干細胞的增殖和分化是腦缺血后神經再生的主要分子機制。近年來，由于中醫藥防治腦卒中具有不良反應少、療效佳等優勢，在急性期、恢復期的臨床治療中得到廣泛應用。然而，其作用機制尚未明確，一定程度上限制了中醫藥在治療缺血性腦卒中方面的發展[3]。因此，本研究從 Notch 信號通路對調節具有自我更新能力的神經干細胞的增殖和分化角度，探討中醫藥治療缺血性腦卒中的可能機制。

Notch基因于1917年被Morgan等發現，它的突變將導致果蠅翅膀出現缺口(Notch)，得名由此而來。Notch廣泛存在于從無脊椎動物到哺乳動物等多個生物，并精確調控細胞增殖、分化、凋亡，在細胞生長和生理功能等方面發揮著重要作用，Notch信號通路在缺血性腦卒中發生、發展中發揮重要作用。

1 Notch信號通路概述

經過長期的進化，成熟的大腦使用了一系列通路來管理認知功能，例如Notch信號通路。Notch信號通路主要包括受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4)、配體(Delta like 1 即 DLL1、DLL3、DLL4 和 Jagged 1、Jagged 2)、CSL-DNA 結合蛋白以及其他效應分子和調節分子。Notch通路的多個組成部分在血管系統中表達，缺乏這些組成部分的小鼠表現出胚胎致死性和血管重塑缺陷[4]。經典的Notch信號通路的激活途徑是通過相鄰細胞的Notch配體與受體結合，Notch受體蛋白經過3次剪切，由胞內段(NICD)釋放入胞質，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，從而激活堿性-螺旋-環-螺旋轉錄抑制因子家族的靶基因(如Hes1、Hes等)發揮調節作用[5]。Notch 信號通路在神經干細胞增殖分化的調節中具有重要作用，是一條高度保守的信號轉導通路。內源性神經干細胞增殖分化潛能為缺血性腦卒中神經修復與重塑提供了可能，Notch 信號轉導通路對神經干細胞增殖分化具有重要調節作用[6]。

1.1 Notch信號通路對缺血性腦卒中神經分化與再生的影響 缺血性腦卒中發生后，會出現神經元腫脹，壞死甚至凋亡。1992年，Reynolds等先后從胎鼠和成鼠紋狀體分離得到神經干細胞，哺乳動物“成年中樞神經系統不再具有神經細胞新生能力”的傳統認識被打破。成年哺乳動物神經干細胞主要聚集區是中樞神經系統中側腦室壁的腦室下區和海馬齒狀回的顆粒下層被證實[7]。Alhajzen等[8]通過小鼠缺血模型的研究發現，Notch配體DLL4在正常灌注的微血管內皮細胞中表達較弱，而缺血后在發芽的毛細血管最前端表達增強。DLL4-Notch信號通過干預血管分支形態發生來調節側支血管的形成。DLL4還通過干預動脈功能和結構來影響血管灌注，其信號激活在再灌注期間血管分支的重組中非常重要[9]。腦缺血后恢復期神經再生是重要的環節，已有實驗證明此過程中有Notch信號通路的參與，如果抑制Notch信號通路，腦內神經干細胞分化為神經元的過程也受阻，這表明腦缺血損傷后Notch信號通路被激活，并且在神經干細胞存活、增生和分化過程中均發揮重要作用[10]。郭娜等[11]通過建立PC12誘導的神經元樣細胞氧糖剝奪(OGD)體外腦缺血模型，觀察Notch受體在腦缺血損傷中的表達變化及其配體Jagged1對缺血損傷的影響，發現OGD的PC12 細胞在3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h的不同時間點Notch1 mRNA的表達量與正常組比較均明顯升高；與對照組相比，外源性Jagged1干預可導致正常及缺血神經元的存活率下降，可見腦缺血損傷過程有Notch信號通路的參與。

1.2 Notch信號通路對腦缺血后血管損傷的影響 神經再生和突觸發生的首要條件是微血管的新生，這對神經功能的恢復有決定性作用。內皮細胞增殖、遷移和重塑是血管新生的主要過程，涉及多條信號通路分子和生長因子，其中一條是Notch信號通路。血管內皮生長因子是血管生長因子中重要的一員，能增加血管通透性、促進血管內皮細胞增殖和血管形成[12]。有研究表明，Notch信號通路的配體 DLL4通過表達可抑制血管內皮生長因子信號，血管內皮細胞的增殖、遷移會因此減少。Kikuchi等[13]采用沒有血管內皮生長因子誘導的小鼠后肢缺血模型，發現匹伐他汀可以通過Notch1介導血管生成和動脈形成。Notch信號通路可以調節血管生成下游的血管內皮生長因子和上游的肝配蛋白 B2(ephrin B2)，胚胎和產后體內的血管形成主要有內皮ephrinB2反向信號的參與。由此可見，Notch 信號通路是調控成年人血管新生的重要組成部分。

2 中醫藥治療缺血性腦卒中Notch信號通路的相關研究

2.1 Notch 信號通路作用靶點的研究 研究顯示，通過應用大腦中動脈阻塞術(MCAO)制備大鼠缺血性腦卒中模型提示，補腎生髓法和益氣活血法兩種中藥復方能夠抑制Notch信號轉導通路Notch1、Jagged1 mRNA或蛋白的過高表達，增強額頂葉或海馬CA1 區Notch3 mRNA及蛋白表達，促進腦卒中后神經細胞修復，影響神經干細胞的增殖和分化[14-15]。馮珂等[16]應用同樣實驗提示健脾益智膠囊可能通過增加 Notch1、Jagged1蛋白及基因的表達，以促進缺血后神經干細胞增殖分化。應用雙側頸總動脈結扎法制備血管性癡呆大鼠模型發現，首烏益智膠囊能保護神經元，維持海馬神經細胞結構與功能的完整，減輕腦缺血對海馬神經元的損傷，增加Notch 信號通路中Notch1、靶基因Hes3及轉導-轉錄活化因子 Stat3 mRNA 的表達[17-18]。趙雅寧等[19]應用4-血管阻斷法制備腦卒中大鼠模型，結果提示參芎化瘀膠囊可增加 Notch1、血管內皮生長因子蛋白的表達，提高神經細胞存活率，保護神經細胞的結構和功能。陳聘婷等[20]證明丹龍醒腦方能通過上調腦卒中大鼠海馬區 Notch1、Notch2 及 Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達水平，促進神經干細胞的增殖。張葉華[21]研究提示，補陽還五湯可能通過增強腦缺血后伴抑郁大鼠腦內Notch信號通路上Notch1、Jaggged1、Hes1及Hes5的表達，調節神經干細胞增殖分化。由此可見，應用補腎益氣、活血化瘀等中醫藥對治療缺血性腦卒中有一定的療效，其作用機制與Notch信號通路的調控作用相關。

2.2 Notch信號通路對腦缺血性細胞凋亡的影響 目前已知調節細胞凋亡的途徑主要有線粒體通路、死亡受體通路、內質網通路3種。大量研究已證實，局灶性腦缺血后所發生的神經元凋亡主要通過以下兩種途徑：由Bc1-2家族基因、Caspase家族基因參與的以線粒體為中心的內源性凋亡途徑；由Fas基因參與的以死亡受體為介導的外源性凋亡途徑[22]。因此，對上述細胞凋亡基因的干預可作為腦缺血治療的潛在靶點。現階段針對中醫藥干預缺血性腦卒中細胞凋亡的研究主要集中在動物實驗領域，臨床研究開展相對較少。閔珉[23]通過對銀杏葉提取物對全腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用的實驗研究證實，銀杏葉提取物中的有效成分EGb761可抑制全腦缺血及其再灌注損傷所導致的大鼠神經元凋亡，該作用可能與增加Bcl-2/Bax比值、減少促凋亡蛋白Bax的表達和增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有關，其抗凋亡作用可能與非磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路有關。

2.3 Notch信號通路對免疫調節的作用 桑芪首烏方是云南省名中醫陸家龍臨床應用數十年的經驗方，方中制首烏，味苦、甘，性微溫，歸肝腎經，善補肝腎，益精血；桑寄生味苦、性平，歸肝腎經，補腎養血而可益肝腎、強筋骨之功效，偏走于肢體筋脈，可治療中風病之肢體強急拘攣或筋骨羸弱癱軟諸癥；配伍黃芪等以益氣活血化瘀，諸藥配伍、合用，肝腎得補，精血得旺，髓海得充，瘀去絡通，且滋補而不留邪，降瀉而不傷正，補中有瀉，寓瀉于補[24]。黃芪多糖、黃芪甲苷為“桑茂首烏”片中的主要成分[25]。王振綱等[26]研究發現黃芪煎劑能夠影響小鼠體內環核苷酸的水平，使小鼠血漿環磷酸腺苷(cAMP)含量增加、環磷酸鳥苷(cGMP)含量減少，可能是黃芪增強小鼠腹腔內巨噬細胞吞噬功能導致。高建峰等[27]在研究黃芪多糖對小鼠脾淋巴細胞內cAMP、cGMP的影響實驗中發現，黃芪多糖可抑制cAMP產生，促進cGMP生成，從而降低cAMP/cGMP比例，提示其可能是通過影響脾臟淋巴細胞信號轉導而實現免疫調節作用。王文平等[28]研究發現黃芪甲苷可通過NO-cGMP途徑增加動脈組織cGMP含量，改善內皮依賴性血管舒張作用。

3 小 結

Notch信號通路在促進膠質再生、維持神經干細胞的增殖中具有重要作用，是腦生發區調節神經干細胞分化和維持平衡的主要分子機制。Notch信號通路上相關分子相互作用，通過Notch通路上其他相關分子抑制神經再生、抑制神經干細胞向神經元及少突膠質細胞分化，是一條信號抑制性轉導通路。本研究對近年來中醫藥治療缺血性腦卒中作用機制進行總結，得出中成藥如健脾益智膠囊、首烏益智膠囊治療缺血性腦卒中療效顯著，其作用機制與Notch信號通路對神經干細胞的調控作用密切相關。在神經系統中，除Notch通路外的多條信號轉導通路參與調控腦缺血后腦內神經干細胞增殖分化進程，各條信號通路通過串話的方式，實現信號通路之間的交流，共同發揮調控作用。

綜上所述，中醫藥治療缺血性腦卒中與 Notch 信號通路對缺血性腦神經干細胞增殖與分化調控作用相關，從Notch信號通路等與其他信號通路進行研究是今后中醫藥治療缺血性腦卒中的研究重點。