人參皂苷Rg1對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響及機制研究

郭施勉，楚英杰

冠心病是指由冠狀動脈血管發生粥樣硬化引起的血管狹窄、阻塞，從而造成心肌缺血、缺氧甚至壞死的心臟疾病，是臨床上常見的心血管疾病[1]。冠心病主要高發于中老年或合并心血管基礎疾病的病人，隨著社會人口老齡化的加快以及生活習慣的改變，冠心病發病率逐年增加，由冠心病導致的猝死也時有發生，嚴重威脅人們的生命健康和安全[2]。人參皂苷Rg1是從人參中提取的一種中藥活性物質，研究表明，人參皂苷Rg1在中樞神經系統、免疫系統及抗腫瘤方面均發揮著重要的調節作用[3]。近代藥理研究證明，人參皂苷對缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭以及心肌缺血再灌注損傷等多種心血管系統疾病具有深遠的臨床意義，但關于人參皂苷Rg1在心血管系統中的作用仍鮮有報道[4]。研究發現，人參皂苷Rg1對神經細胞內質網的應激反應具有一定的抑制作用，可抑制神經細胞凋亡[5]。本研究擬通過構建大鼠冠心病模型，在體內外實驗中觀察人參皂苷Rg1對心肌細胞凋亡的作用，為人參皂苷Rg1在冠心病中的作用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠50只，體質量(200±20)g，動物房中適應性飼養1周，室溫(22±5)℃，相對濕度(50±5)%，通風良好，環境安靜，自由飲水、攝食。實驗動物購于廣東省醫學實驗動物中心。所有動物實驗均經倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑 人參總皂苷 Rg1(浙江康恩貝制藥股份有限公司)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國PeproTech公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體均購自美國Abcam公司；Tunel試劑盒(美國Roche公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、蛋白上樣緩沖液均購自中國上海碧云天生物工程研究所；多聚甲醛、無水乙醇均產自天津化學試劑廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型構建 本研究采用高脂飲食飼養聯合腹腔注射垂體后葉素構建大鼠冠心病模型，每日高脂飲食連續飼養6周后，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續3次[6]。實驗大鼠隨機分為對照組、模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組，每組10只。對照組常規飲食，不進行冠心病造模，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；模型組構建冠心病模型，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組均構建冠心病模型，術后分別給予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg人參皂苷Rg1灌胃，每日1次。所有實驗動物均連續灌胃12周。

1.3.2 心肌組織缺血區細胞形態觀察 斷頭法處理實驗大鼠，各組大鼠取適量心肌均勻切成5片，每片厚度約為2.0 mm，置于包埋盒內，浸于4%多聚甲醛中固定過夜。常規乙醇梯度脫水，隨后取出，置于包埋機中2 h進行石蠟包埋。隨后將切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脫蠟，采用蘇木素染色40 s，1%鹽酸乙醇沖洗后，置于伊紅溶液中染色3 s后自來水沖洗。沖洗后將切片置于梯度乙醇及二甲苯溶液中進行脫水和透明處理。使用中性樹脂覆蓋玻片進行封固。于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統計。

1.3.3 心肌組織中炎性因子含量檢測 每只大鼠取心肌組織約50 mg，制成10%的勻漿液，3 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測上清液中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。使用酶標儀(美國Molecular Devices)在450 nm下測定OD值。所有實驗重復3次。

1.3.4 SOD、MDA含量檢測 每只大鼠取心肌組織約50 mg，于預冷生理鹽水中漂洗后，除去血液，采用手術剪將心肌組織塊剪碎，轉移至勻漿管中，制成10%的組織漿液。3 000 r/min離心10 min，使組織勻漿化，取上清液，嚴格按照各個試劑盒說明書操作，檢測心肌組織SOD活性及MDA含量。所有實驗重復3次。

1.3.5 凋亡相關蛋白 mRNA表達情況檢測 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測心肌組織中凋亡相關蛋白 mRNA表達情況。采用Trizol法提取各組大鼠心肌組織細胞總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。參照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄和RT-PCR檢測，反應程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，40個循環，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s收集熒光信號，計算相對定量結果，所有實驗重復3次。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.3.6 凋亡相關蛋白表達情況檢測 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織中凋亡相關蛋白表達情況。每只大鼠取心肌組織約50 mg，加入組織蛋白提取液，4 ℃充分碾磨10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA 蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，各組以30～60 μg 相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行凝膠電泳，隨后使用半干轉儀轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂牛奶封閉 1 h，抗Bax單克隆抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3單克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過夜。PBS-Tween 20液漂洗，HRP標記的二抗反應，PBS-Tween 20液洗膜，化學發光法(ECL)顯色，凝膠成像儀曝光拍照。檢測各組實驗大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標志蛋白表達情況。所有實驗重復3次，灰度值采用Image Pro Plus 6.0軟件檢測分析。

2 結 果

2.1 5組心肌組織細胞形態比較 光學顯微鏡下觀察，對照組大鼠心肌組織細胞形態正常，排列整齊，細胞核膜完整，核仁清晰可見，無明顯核固縮表現；模型組大鼠心肌組織細胞體積明顯縮小，核固縮明顯，呈深染色表現，細胞水腫明顯，細胞間隙有明顯的細胞浸潤表現，可見明顯的壞死細胞；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織細胞水腫狀態均較模型組有所改善，細胞水腫狀態呈現不同程度減輕，其中，人參皂苷Rg1高劑量組細胞腫脹程度緩解最為明顯，其細胞核深染明顯減輕，細胞皺縮明顯緩解，細胞形態基本趨于正常。詳見圖1。

圖1 5組心肌組織細胞形態比較

2.2 5組心肌組織炎性因子含量比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌組織炎性因子含量比較 () 單位：ng/L

2.3 5組SOD活性及MDA含量比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 5組SOD活性及MDA含量比較 ()

2.4 5組凋亡相關蛋白mRNA表達比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 5組凋亡相關蛋白mRNA表達比較

2.5 5組凋亡相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 5組凋亡相關蛋白表達比較

3 討 論

冠心病是一類常見的嚴重危害人類健康的心血管系統疾病，其發生與動脈粥樣硬化、血管再狹窄、心肌缺血再灌注損傷等密切相關[7]。研究顯示，心肌細胞凋亡在動脈粥樣硬化、心肌缺血、再灌注損傷以及急性心肌梗死等心血管系統疾病的發生發展中扮演著重要角色[8]。細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是細胞自我有效消亡的過程，在形態特征上有別于細胞壞死，但同屬于細胞死亡[9]。隨著對冠心病發病機制研究的不斷深入，心肌細胞凋亡與冠心病的關系逐漸成為臨床研究的熱點話題。

人參皂苷是人參的主要活性成分，對神經系統、心腦血管系統、消化系統、免疫系統等具有不同程度的保護作用，尤其在心血管系統疾病的防治中具有重要意義[10]。人參皂苷Rg1屬于人參三醇型皂苷，有研究顯示，人參皂苷Rg1對缺血心肌具有保護作用，不僅可通過與糖皮質激素受體結合，促進血管內皮細胞產生一氧化氮(NO)，擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，保護心肌功能，還可通過降低缺血缺氧心肌細胞內鈣離子濃度，調節心肌細胞內鈣離子平衡紊亂，保護心肌細胞[11-12]。近年來研究發現，人參皂苷Rg1在血管新生方面也具有積極作用，可通過促進內皮細胞增殖、遷移，參與血管重構與新生，從而發揮心肌保護作用[13-14]。此外，人參皂苷Rg1在一定程度上可增加冠心病病灶區的血管密度，提高血管內皮生長因子表達，在急性心肌梗死中發揮保護作用[15]。人參皂苷Rg1已作為復方制劑的成分之一投入到臨床使用中，目前臨床上廣泛應用的血栓通注射液的主要成分即為人參皂苷Rg1，但目前人參皂苷Rg1心肌保護作用的研究多在細胞水平，人參皂苷Rg1通過何種途徑影響冠心病的發展和預后仍不清楚。本研究以人參皂苷Rg1對冠心病心肌細胞凋亡的分子機制為切入點，以大鼠冠心病模型為研究對象，探討人參皂苷Rg1影響心肌細胞凋亡的可能機制。

本研究結果顯示，給予人參皂苷Rg1不同劑量干預后，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌細胞水腫狀態均較模型組改善，細胞水腫狀態呈現不同程度減輕，提示人參皂苷Rg1對于緩解心肌細胞水腫有一定作用，且人參皂苷Rg1高劑量組細胞腫脹程度緩解最為明顯。IL-1β是炎癥反應的重要介質，可通過刺激黏附分子異常高表達，介導粒細胞在血管內皮細胞間的黏附和浸潤，還可通過刺激血管內皮細胞，誘導相關血管活性物質的合成與分泌，促進微血栓的形成[16]。IL-6在缺血再灌注損傷發病早期即可通過異常高表達刺激炎性細胞介質釋放發揮促炎作用[17]。TNF-α作為一種常見的炎性因子，在眾多炎癥中均有著明顯的異常表達，主要在炎癥發生的初始階段發揮前炎性因子作用[18]。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，且人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于人參皂苷Rg1低、中高劑量組(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1能有效抑制冠心病發生過程中的炎癥反應，且其對心肌細胞損傷的抗炎效應與劑量密切相關。SOD廣泛存在于人體，是心肌組織中清除自由基的有效成分，MDA是脂質過氧化的最終產物，可通過干預氧自由基的生成量間接反映細胞損傷的程度[19-20]。本實驗結果顯示，模型組SOD活性明顯低于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，而MDA含量明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，表明人參皂苷Rg1能增強冠心病大鼠心肌組織中SOD活性，同時降低MDA水平，從而減輕氧自由基的破壞作用，保護心肌細胞，與其抗炎作用一致。與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達量明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA及蛋白表達量則明顯升高(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1對冠心病心肌組織細胞凋亡具有一定的抑制作用。本研究實驗結果表明，人參皂苷Rg1在降低炎癥水平及氧自由基作用的同時，還可抑制心肌細胞凋亡，其抑制凋亡效應可能與線粒體凋亡信號通路的失活有關。

綜上所述，人參皂苷Rg1可通過降低損傷后炎癥反應、抗氧化、抑制線粒體凋亡信號通路作用，發揮對冠心病大鼠心肌細胞的保護作用，其作用效果與干預劑量明顯相關。