黃角顆粒預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護機制

熊 岳，李鐵成

急性心肌缺血是由多種原因引起的心臟血液灌注急劇減少或中斷，導致心臟供氧能力下降，心肌能量代謝異常，心臟不能正常工作的病理生理狀態。當心肌發生急性缺血缺氧時，臨床主要表現為胸悶、胸痛、氣短、心悸、大汗等癥狀，嚴重時甚至出現呼吸困難。通過治療可以使閉塞的冠狀動脈再通，缺血的心肌重新得到灌注，瀕臨壞死的心肌得以存活，損傷及壞死范圍縮小，減輕梗死后心肌重塑。但是再灌注治療有利也有弊，盡管再灌注獲益顯著，但血流的恢復和再供氧的最初幾分鐘內常常加重了組織損傷和炎癥反應，這種現象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI)。中藥治療心肌缺血再灌注損傷因不良反應低、療效確切，作用于疾病的多個環節而倍受重視，黃角顆粒是對腦缺血再灌注損傷具有明確保護作用的藥物[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取體質量220～250 g的SD雄性大鼠30只，大鼠均由錦州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCKK(遼)2009-0004，正常飼喂3 d。

1.2 實驗試劑 本實驗所用黃角顆粒由大黃和水牛角兩味中藥按1∶2比例配制(錦州市中心醫院中醫科制劑室配制)；氯化硝基四氮唑藍(NBT)、兔抗人p-JAK2多克隆抗體、兔抗人p-STAT3單克隆抗體均購自美國Amresco公司；蘇木精-伊紅(HE)染色、NBT染色試劑購自金克隆(北京)生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血清超氧化物歧化酶(SOD)和血漿丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量檢測試劑盒購自上海酶聯生科技技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 30只大鼠正常飼養3 d，確定進食、活動及精神狀態均無異常后，隨機分為假手術組、模型組及黃角顆粒組，每組10只。假手術組和模型組每天以10 mL/kg生理鹽水灌胃1次，連續灌胃5 d；黃角顆粒組每天以10 g/kg黃角顆粒溶液灌胃1次，濃度1 g/mL，連續灌胃5 d。

1.3.2 模型制備 實驗周期結束后的當天晚上給予大鼠禁食不禁水，第2天稱重。將大鼠仰臥位固定于實驗架上，腹腔注射20%烏拉坦全身浸潤麻醉，氣管插管，連接呼吸機，調節呼吸機參數(呼吸頻率55次/min，每100 g潮氣量1.5 mL)，同時將針形電極插入大鼠四肢皮下，連接心電圖機記錄心電圖，記錄標準Ⅱ導聯心電圖。開胸，充分暴露心臟，分離左冠狀動脈前降支，除假手術組只開胸不行冠狀動脈結扎外，其余各組將冠狀動脈前降支前端用無創傷縫合線結扎[2]。結扎30 min后，予再灌注治療60 min。結扎冠狀動脈前降支后見Ⅱ導聯心電圖ST段抬高，恢復心肌灌注后ST段回落50%以上為大鼠心肌缺血再灌注模型造模成功的標志。

1.3.3 血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量檢測 大鼠再灌注時間結束后，每只大鼠右心房取血，血液冰上靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，將上層血清置于-80 ℃冰箱中備用。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量。

1.3.4 心肌梗死面積測定 取血完成后，取下大鼠心臟，去除心房及右心室后將殘余心肌組織放入冰箱中，-20 ℃條件下冷凍1 h，待組織變硬后取出，于冠狀動脈結扎線下沿平行于冠狀溝方向將心肌組織切成等厚的5片，再放入0.1% 氯化硝基四氮唑藍(NBT)溶液中，在37 ℃水浴鍋中搖動染色10 min。正常心肌經NBT染色后為暗紫色，梗死部位心肌經染色后為紅色或蒼白色，粗略估算心肌梗死面積。

1.3.5 TNF-α測定 在大鼠TNF-α單克隆抗體的酶標孔中加TNF-α溫育。溫育后加入生物素標記的抗TNF-α抗體，與鏈霉親和素-HRP結合形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，加入底物A和B后變成藍色，而后在酸的作用下轉化成最終的黃色。TNF-α濃度越高，顏色越深。放射免疫測量法測量TNF-α水平。

1.3.6 p-JKA2和p-STAT3檢測 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測p-JKA2和p-STAT3水平。取保存于-80 ℃的各組心肌組織100 mg，嚴格按照抗體使用說明書的操作方法檢測蛋白水平并拍照保存結果。成像結果采用Image J 分析。

2 結 果

2.1 3組心肌梗死面積比較 假手術組均為正常心肌，模型組心肌梗死面積明顯增大，黃角顆粒組心肌梗死面積與模型組比較呈下降趨勢。詳見圖1。

圖1 3組心肌梗死面積比較

2.2 3組血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比較 與假手術組比較，模型組血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明顯升高，SOD活性明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，黃角顆粒組血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明顯下降，SOD水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比較 ()

2.3 3組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，黃角顆粒組大鼠心肌組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

模型組與假手術組比較，＊ P<0.05；黃角顆粒組與模型組比較，# P<0.05

模型組與假手術組比較，＊ P<0.05；黃角顆粒組與模型組比較，# P<0.05

3 討 論

黃角顆粒是由大黃和水牛角兩味中藥的破壁粉劑按照1∶2的比例配置而成，中藥大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效；水牛角是中藥犀角的代用品，具有清熱解毒、涼血定驚的功效，二者合用有通腑解毒、涼血定驚之功效[3-4]。陳國華等[5]觀察黃角顆粒對大腦中動脈栓塞的大鼠血漿中炎性因子的變化發現，經過提前給予黃角顆粒的大鼠與模型組比較，血清MDA、TNF-α、NO水平明顯降低，SOD水平有所升高，提示黃角顆粒可以有效清除氧自由基，減輕自由基對缺血大腦的進一步損傷。潘宋斌等[3]通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，發現經過黃角顆粒預處理的大鼠與模型組比較，不僅可以抑制炎癥反應，還可以使腦組織中的cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9和Bax的表達降低，說明黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷的保護作用還與減少細胞凋亡有關，而黃角顆粒在心肌缺血再灌注損傷中的應用鮮有報道。

心肌缺血再灌注損傷是指發生急性缺血的心肌在重新恢復血液灌注后，心肌細胞損傷反而加重，損傷范圍進一步擴大，同時影響心臟的功能、代謝和結構。研究發現，可能與氧自由基的產生增多、細胞內鈣超載、炎癥反應及細胞凋亡有關[6-8]。本研究從黃角顆粒減輕腦缺血再灌注損傷出發，進一步證實其對心肌缺血再灌注損傷具有同樣的保護作用。cTn及心肌酶譜是判定心肌損傷及壞死最常用的生化指標，cTn包括cTnC、cTnI和cTnT 3個亞型，其中cTnI僅存在于心肌，有100%的心肌特異性[9]。心肌酶譜是判定心肌壞死敏感性較高的特異性生化指標，CK-MB不僅可以用于判斷心肌梗死，同時可以判定溶栓治療后梗死相關的動脈是否再通。本實驗發現，發生心肌缺血再灌注損傷后大鼠血清中的cTnI及CK-MB水平明顯升高(P<0.01)，而經過黃角顆粒預處理后的大鼠能夠明顯降低血清cTnI及CK-MB水平(P<0.05)，可有效減少酶類物質釋放入血，降低缺血再灌注后的心肌損傷。自由基的異常增多在心肌缺血再灌注損傷的病理過程中發揮著十分重要的作用。在正常生理狀態下，SOD等抗氧化酶作為人體內關鍵的氧自由基清除劑，能有效清除超氧自由基，使其轉變成氧分子和水，當心肌發生急性缺血時，SOD活性減弱，體內氧自由基無法迅速清除，氧自由基的不斷堆積使生物膜發生脂質過氧化反應，導致一系列脂質自由基和降解產物MDA的產生，致使心肌細胞受損，加重細胞結構及功能障礙，因此，細胞內SOD的活性以及MDA含量能夠準確反映氧自由基的含量，是判斷細胞損傷程度的標志[10]。本研究結果顯示，經黃角顆粒預處理的大鼠較模型組SOD含量明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯下降(P<0.05)，說明黃角顆粒能夠有效清除氧自由基，減少炎性因子的釋放，降低炎癥反應，減少心肌細胞損傷。TNF-α等炎性因子的大量釋放可反饋性產生氧自由基，導致氧自由基堆積，細胞結構和功能受損。TNF-α由巨噬細胞產生，是參與炎癥反應的重要因子，缺血再灌注時大量表達與分泌，并可通過自分泌方式作用于其他巨噬細胞，引起更多巨噬細胞的活化，從而放大炎癥反應，其表達水平快速升高，進一步誘導細胞壞死，加重心肌組織損傷[11-12]。本研究結果顯示，發生心肌缺血再灌注損傷后大鼠血清中TNF-α水平明顯增高(P<0.01)，經過黃角顆粒預處理后的大鼠血清TNF-α水平明顯減少(P<0.05)，減輕缺血再灌注損傷。

JAK/STAT信號通路是調控細胞免疫、增殖、分化、凋亡等多種病理生理過程的重要細胞內信號轉導通路[13]。大量研究表明，JAK2/STAT3信號通路是炎癥反應中的經典通路，可通過對下游眾多靶點發揮調控作用，如糖原合成酶激酶3、核轉錄因子κB、內皮型一氧化氮合酶以及TNF-α等[14-16]。發生急性心肌缺血后，可快速導致JAK2和STAT3磷酸化，從而使 JAK/STAT信號通路激活，并發揮內源性心肌保護作用。本研究結果表明，給予黃角顆粒藥物組大鼠的p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平表達明顯增加，說明黃角顆粒能夠激活JAK/STAT信號通路的傳導，從而對缺血后的心肌起到一定保護作用。