實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在手足口病中的診斷價(jià)值

李文瑞 葉敏南 何月敬 梁健行 呂 芬 黎四平 張耀忠

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523320；2.廣東省東莞市兒科研究所，廣東東莞 523320

手足口病在醫(yī)學(xué)上較為多發(fā)，它主要是由腸道病毒感染而導(dǎo)致的傳染性疾病，近年來(lái)的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)此病癥已成為兒童的常見(jiàn)疾病之一[1-2]，發(fā)病時(shí)間主要集中在春夏季，尤其是男童的數(shù)量明顯多于女童，但年齡越大的兒童，發(fā)病會(huì)越少[3]。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、低熱、口腔、手部及足部出現(xiàn)小潰瘍，大部分兒童在患有手足口病后會(huì)自行康復(fù)，但也有少部分兒童的病情會(huì)進(jìn)一步加重而引發(fā)肺水腫和心肌炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)還有可能導(dǎo)致兒童死亡[4-5]。臨床對(duì)手足口病的診斷依靠已經(jīng)出現(xiàn)疾病或癥狀來(lái)判斷，癥狀不明顯時(shí)會(huì)導(dǎo)致漏診，影響治療，因此選擇一種安全有效的方式對(duì)其進(jìn)行診斷，對(duì)于兒童的康復(fù)來(lái)說(shuō)極為重要, QPCR 檢測(cè)是臨床上常見(jiàn)的一種檢測(cè)方法，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）法檢測(cè)手足口病，評(píng)價(jià)其臨床價(jià)值，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1—12 月我院手足口病兒童163 例作為本次研究的試驗(yàn)組，其中女72 例，男91 例，年齡13 d ～8 歲，平均（4.7±2.9）歲，該組患者均符合《兒科手足口病理學(xué)診斷規(guī)范》中相關(guān)病癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其基本資料均完整登記。選取同期在我院體檢的161 例兒童作為對(duì)照組，其中女74 例，男87例，年齡21 d～7歲，平均（5.2±1.7）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在8 歲以下的兒童；②有手、口腔等出現(xiàn)皰疹且疑似手足口病的有關(guān)癥狀兒童；③完善腸道病毒PCR 相關(guān)檢查的兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在基礎(chǔ)性疾病或嚴(yán)重精神障礙的兒童；②有其他病毒性感染兒童；③未完善腸道病毒PCR 相關(guān)檢查的兒童。兩組兒童一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)采用ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國(guó)賽默飛）對(duì)CoxA16、EV、EV71 進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)條件：40℃ 25 min，1 個(gè)循環(huán)；94℃ 3 min，1 個(gè)循環(huán)；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。試劑采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司原裝試劑。

1.3 方法

標(biāo)本采集：采集兒童糞便標(biāo)本6 ～9 g，立即放入專用采便管內(nèi)，0 ℃冰壺保存，30 min 內(nèi)送檢。核酸提取及檢測(cè)等所有操作均說(shuō)明書進(jìn)行，操作人員都取得相應(yīng)資格證。陽(yáng)性結(jié)果需同時(shí)滿足下列3項(xiàng)：①陰性質(zhì)控品。無(wú)典型S 型擴(kuò)增曲線或無(wú)Ct 值；②陽(yáng)性質(zhì)控品。呈典型S 型擴(kuò)增曲線且Ct ≤30；③檢測(cè)樣本結(jié)果呈S 型擴(kuò)增曲線且Ct 值≤34.9。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

試驗(yàn)組163 例兒童中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)陽(yáng)性144 例，其中女61 例，男83 例，陽(yáng)性為144 例（88.34%），對(duì)照組161 例兒童中陽(yáng)性3 例，陽(yáng)性為3 例（1.86%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.873，P=0.000 ＜0.05）。對(duì) 照 組144 例 手足口病患兒中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%），其次是CA16，有33 例（22.92%），最后是EV71，有9 例（6.25%）。

3 討論

手足口病是由于腸道病毒感染而導(dǎo)致起的兒童傳染病，潛伏期大約為1 周左右[7-8]，其發(fā)病時(shí)間分布較為廣泛，并且不存在明顯的地區(qū)性，每年的春夏秋冬均有發(fā)病的可能，但在我國(guó)以夏秋季為高發(fā)季節(jié)，在疾病的爆發(fā)期間，托兒所及幼兒園呈現(xiàn)集體感染，其具有極強(qiáng)的傳染性，主要通過(guò)患者的咽喉分泌物、皰疹液、唾液、糞便進(jìn)行傳播，能夠在短時(shí)間內(nèi)形成較大的規(guī)模流行[9]。我國(guó)目前出現(xiàn)手足口病的兒童年齡通常在5 歲以下并且以男童為主[10]，而大部分兒童的發(fā)病時(shí)間都在每年的5—10 月，兒童的發(fā)病持續(xù)時(shí)間通常在2 ～7 d，尤其是2 ～4 歲的兒童發(fā)病率最高，隨著兒童年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率會(huì)逐漸降低[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道腸道病毒中的EV71 病毒感染兒童，隨著其感染癥狀的不斷發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)較為明顯的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[12-13]，具有較大的危害性以及致死率。

QPCR 技術(shù)是核酸檢測(cè)中常用方法，這種技術(shù)不僅具有普通PCR 的高靈敏性，并且在檢驗(yàn)過(guò)程中將熒光探針應(yīng)用于其中，同時(shí)具有DNA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性[14]，檢測(cè)過(guò)程中總時(shí)長(zhǎng)大約2.5 h，加快了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)于手足口病患者的確診及治療提供了相應(yīng)的證據(jù)，也為患者后續(xù)的治療工作開(kāi)展提供了參考依據(jù)[15]。在本研究結(jié)果中顯示試驗(yàn)組163 例兒童中QPCR 檢測(cè)陽(yáng)性144 例，陽(yáng)性率為88.34%，對(duì)照組161 例兒童中陽(yáng)性3 例，陽(yáng)性率1.86%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組有3 例陽(yáng)性可能是癥狀不明顯的手足口病。我們研究還發(fā)現(xiàn)，手足口患者中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%）。因此將QPCR 檢測(cè)方案應(yīng)用于手足口病的檢測(cè)中，患兒的診斷陽(yáng)性率與實(shí)驗(yàn)室病理檢查結(jié)果無(wú)明顯差異。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)手足口病的早期診斷有較高的臨床價(jià)值，對(duì)于后續(xù)的治療工作有積極意義，值得臨床上推廣使用。