拉曼光譜技術識別不同病因膿毒癥的潛力

杜 金 夏書香

1.延邊大學臨床學院，吉林延吉 133000；2.延邊大學附屬醫院重癥醫學科，吉林延吉 133000

膿毒癥是臨床上非常緊急的一種醫療情況，最初定義為由感染引起的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及其所致的各器官功能障礙。由于原定義缺乏特異性和敏感性，膿毒癥于2016年被美國重癥醫學會（Society of Critical Care Medicine，SCCM）聯合歐洲危重病醫學會（European Society of Intensive Care Medicine，ESICM）重新定義為一種由嚴重感染引起機體免疫反應失調導致的致命性器官功能障礙（即sepsis 3.0）[1-2]。該新定義將診斷重點從SIRS 轉移到器官功能障礙，并加入了序貫器官衰竭評分（Sequential Organ Failure Assessment，SOFA），還提出快速序貫器官衰竭評分（quick Sequential Organ Failure Assessment，qSOFA）[2]，為臨床醫生識別膿毒癥患者提供有效信息并指導有效治療策略的實施。

1 膿毒癥概述及其臨床常用生物標志物

1.1 膿毒癥概述

膿毒癥是由各種病原體感染引起的嚴重疾病，感染源可以是細菌、真菌、病毒等病原微生物，其中由細菌感染所致膿毒癥約占70%，病毒感染所致膿毒癥約占20%，余下10%多為真菌感染[3]。膿毒癥有著非常高的死亡率，若未及時采取治療措施，將大大增加患者的死亡風險。有研究顯示[1]，膿毒癥患者接受有效治療的時間每延遲1 h，死亡率將增加5%～10%。因此，臨床上需要對不同病因所致膿毒癥作出快速識別，以盡早對患者采取有效管理。

如今，膿毒癥已成為世界上導致感染患者死亡率增加的主要原因之一，也是目前重癥監護病房（intensive care unit，ICU）面臨的一大難題，特別是其誘發的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），已成為ICU 內危重患者的主要死亡原因[4]。由于臨床上缺乏針對膿毒癥的特異性指標，目前仍以耗時較長的實驗室檢查來輔助確認患者是否存在潛在感染，因此臨床上迫切需要一種快速、高效的檢測方法，以盡快明確膿毒癥及其潛在原因。

1.2 臨床常用輔助診斷膿毒癥的生物標志物

由于膿毒癥大多由病原微生物感染所致，故目前臨床上大多通過血培養確定病原體種類以明確膿毒癥病因，同時為膿毒癥患者的診斷及治療提供有效信息，但由于血培養耗時較長，容易對患者接受治療的時間造成延遲，還易出現假陽性和假陰性結果[5]，因此臨床上常聯合降鈣素原（procalcitonin，PCT），C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和外周血白細胞（white blood cells，WBC）等多種生物標志物輔助診斷膿毒癥。

PCT 是臨床上常用于輔助診斷膿毒癥的可靠生物標志物之一，與非膿毒癥患者比較，膿毒癥患者的血清PCT 值明顯升高，故血清PCT 值持續升高可提示存在膿毒癥。此外，在膿毒癥不同發展階段血PCT值也不相同，膿毒癥早期血PCT 水平較低，而在膿毒性休克等嚴重階段血PCT 水平則明顯升高[6]。盡管如此，在最新的“拯救膿毒癥運動（surviving sepsis campaign，SSC）”指南中指出，PCT 可用于診斷感染但不能識別膿毒癥病因[7]，其在膿毒癥中最主要的作用是指導抗生素的合理使用。

CRP 也是臨床上常用于輔助檢測感染及膿毒癥存在的生物標志物，它是一種急性反應蛋白，由炎癥及組織損傷后產生的細胞因子誘導肝臟產生，一般在感染后的4～6 h 內開始逐漸升高。但其缺乏特異性，即在某些非感染情況下體內CRP 水平也會升高[8]。

WBC 計數與分類因檢測價格低、 檢測速度相對較快，也成為目前診斷感染性疾病的常用指標，其中以中性粒細胞占主要地位。研究發現[9]，該感染指標易受到許多因素干擾，比如嚴重的組織損傷、血細胞破壞、急性中毒、急性大出血、血液系統疾病以及某些物理、化學因素損傷等都會影響體內WBC 的數量變化，使其在早期識別膿毒癥方面有一定局限，無法做出準確識別。

2 新型分子檢測技術——拉曼光譜

2.1 拉曼光譜的技術原理

拉曼光譜由印度物理學家Raman[10]于1928年觀測到，因此該技術被命名為“拉曼光譜”。拉曼光譜技術是一種利用單色光源照射被檢樣品，通過探測入射光與被檢樣品分子之間產生的非彈性散射來反映不同樣品的分子結構及組成，進而對不同種類的病原微生物做出快速區分的新型分子檢測技術[11]。由于不同分子在光照后吸收的能量不同，故振動產生的光譜強度也不相同。光譜強度的高低與樣品中所含分子的濃度密切相關，分子濃度越高，呈現的光譜越強，提示該分子的可能性也就越大[11]。拉曼光譜技術正是根據不同分子產生的不同強度的特征性光譜對其做出識別的。

2.2 常用新型拉曼光譜技術——表面增強拉曼光譜

由于光子發生非彈性散射的概率非常低，大約每106 個光子中才出現一個非彈性散射[12]，使得普通拉曼光譜技術產生的信號通常很弱。20 世紀70年代，Fleischmann 等[13]在測量吡啶在粗糙銀電極上的拉曼散射時偶然發現，吸附在粗糙金屬表面的分子可以顯著增強原本微弱的普通拉曼光譜信號，信號強度甚至可增至原來的百萬倍，并能檢測出吸附于金屬表面的單層物種。基于這一發現，表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術便初步建立起來，成為一種新型的拉曼光譜技術。此后，研究人員相繼研發了其他不同類型的新型拉曼光譜技術來增強普通拉曼光譜的信號強度，但SERS 是最常用的新型拉曼光譜技術之一[14]。

SERS 通過利用金屬粗糙表面或向樣品中加入金屬納米顆粒來增強普通拉曼光譜信號[15]。研究常用的金屬材料有金和銀兩種，兩者各有優缺點：金不易被氧化，但利用金增強拉曼信號的程度比銀弱；銀增強拉曼信號的程度比金強，但容易被氧化[16]。SERS 在研究中識別樣品分子的方法有兩種：無標記檢測和使用SERS 標簽的間接檢測[17]。研究表明[18]，SERS 能夠對侵入人體的病原微生物進行快速識別和區分，并可分別對存活和死亡的細菌種群進行量化。

3 拉曼光譜技術識別不同病原體所致膿毒癥的潛力

3.1 識別細菌所致膿毒癥的潛力

臨床上引起膿毒癥的細菌類別有很多，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等，其中金黃色葡萄球菌是導致膿毒癥的重要感染性因素之一，可產生各種毒力因子，且常分離出耐藥性金黃色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[19]。Potluri 等[20]開發了一種SERS 納米標記結合聚合酶鏈反應的MRSA 鑒別方法，結果表明基于SERS 的檢測方法具有時間短、靈敏度高的優點。Ciloglu 等[21]利用SERS 結合機器學習技術對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌以及嗜肺軍團菌（對照組）做出研究，最終證明SERS 結合機器學習技術是一種有效區分敏感細菌的可靠方法。此外，在Ho 等[22]的研究設計中通過鍍金的二氧化硅基質獲得細菌細胞拉曼光譜，采用最先進的卷積神經網絡圖像分類技術對30株細菌分離株進行區分，得出拉曼光譜技術在鑒別細菌方面有著較高準確度的結論。Kim 等[23]采用SERS 功能化底物對7 株大腸埃希菌分離株進行了鑒定，驗證了拉曼光譜技術對未知大腸埃希菌亞型進行快速分型的可行性。Wang 等[24]開展了一項在SERS 基礎上使用硼酸功能化的多巴胺包被的Au@Ag 納米顆粒作為探針檢測致病菌的研究，該研究于30 min 內便對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌作出分類。

3.2 識別真菌所致膿毒癥的潛力

除細菌外，念珠菌、霉菌等真菌也是導致膿毒癥發生的常見病原微生物。Hu 等[25]在研究中使用預先制備的Fe3O4@PEI（PEI 為聚乙烯亞胺）與帶正電荷的銀納米顆粒（AgNPs+）聯合SERS 用于念珠菌的檢測，采用正交偏最小二乘判別分析作為多因素分析工具直接從血清中鑒定念珠菌，而不是破壞細胞壁從真菌體內提取DNA 檢測，經驗證，該方法具有良好的分類能力，能夠明確區分常見念珠菌，也是首個直接從血清中鑒定真菌的方法。Strycker 等[26]開發了一種利用785 nm 偏移激發拉曼差異技術結合神經網絡的模型對10 種具有醫學重要性的霉菌分生孢子的拉曼光譜進行檢測，最終成功對研究中的霉菌分生孢子的拉曼光譜作出了快速、準確的鑒別。

3.3 識別病毒所致膿毒癥的潛力

病毒性膿毒癥常見病原體有流感病毒、 冠狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒等。Asif 等[27-28]在利用SERS檢測SARS-CoV-2 的研究中表明，拉曼光譜技術在鑒別病毒方面具有很大潛力，可作為快速檢測各種病毒的有效工具。Lim 等[29]的研究通過SERS 獲取病毒感染細胞的拉曼光譜信號，采用PCA 分析不同病毒拉曼光譜的關鍵特征，最終成功區分了由不同流感病毒感染的細胞。Dou 等[30]演示了一種基于納米級拉曼和紅外光譜的新型檢測方法，這種雙峰成像方法可以提供不同但互補的復雜生物標本的結構信息，有助于病毒種類的快速鑒定。Wang 等[31]將Fe3O4@Ag 納米顆粒作為磁性SERS 納米標簽制作了基于SERS 的生物傳感器，以高靈敏度快速完成了甲型H1N1 流感和人腺病毒等兩種呼吸道病毒的檢測。此外，有研究表明，拉曼光譜技術還可能是定量研究宿主感染過程中活病毒和死病毒動力學的有力工具[32-33]。

4 展望

綜上所述，拉曼光譜技術在識別不同病因所致膿毒癥方面表現出強大的分析潛力及發展空間。盡管該技術可通過分析病原微生物的特異性光學特征明確膿毒癥病因，但將其轉換到臨床環境中常規使用仍然是一個難題。解決這一難題的關鍵在于研制出一種成本低、便于操作且靈敏度高的振動光譜分析儀以及構建分子光譜數據庫。目前，研究者們正在努力減少拉曼光譜技術對臨床環境的種種要求，以推動該技術盡快應用于臨床環境中。