miRNA-34家族在宮頸癌中作用機制的研究進展

楊世慧 劉志強 蓋 娜 王志敏 李明秀

濱州醫學院附屬醫院婦科，山東濱州 256600

宮頸癌是女性第四大常見癌癥，是女性面臨的主要健康問題[1]。Benard 等[2]研究證實，人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的主要病因，自從引入HPV 疫苗以來，宮頸癌的發病率每年下降1%~1.9%，但仍有50%以上病例是在晚期階段被發現。不僅如此，對于早期診斷的婦女，經及時的手術治療或放化療后的復發率為10%~20%，而對于晚期診斷的婦女，復發率可達70%[3]。2019年，美國數據分析將診斷出約1.3 萬例新的宮頸浸潤性癌，預估約4000 名婦女死于這種疾病[4]。因此，晚期及復發性宮頸癌的治療在婦科腫瘤界仍是一個巨大的挑戰。宮頸癌的發病機制錯綜復雜，盡管已有大量研究從基因和蛋白水平對其進行探索，但目前尚不十分明確。因此，尋找高靈敏度和特異度的分子標記物對于宮頸癌的早期診斷、靶向治療以及監測預后至關重要。Wong 等[5]研究發現，miRNA 家族中的miRNA-34s 在乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中顯著低表達，并通過腫瘤發生過程中幾大重要分子通路介導抑癌作用。目前國內關于miR-34s 在宮頸癌中作用機制的總結并不多，本文概述了miRNA-34 家族的起源及其在腫瘤中的分子作用，總結了它在宮頸癌發病機制中的研究新進展，現報道如下。

1 microRNA-34 家族的生物學起源

microRNAs 是一類長度僅為18~25 個核苷酸的非編碼RNA，其中miR-34 家族在生物進化過程中高度保守且穩定表達，其通過與靶mRNA 的3′UTR的互補序列結合，對靶基因的蛋白表達產生負性調控作用[6]。miR-34s 包含3 個家族成員：miRNA-34a、miRNA-34b 和miRNA-34c[7]。哺乳動物中的這三種亞型在不同組織中的表達存在特異性，Bommer 等[8]通過基因相關分析和染色質免疫沉淀測定得出，各細胞系和組織中miRNA-34 家族的豐度直接受到p53 的調控。在神經母細胞瘤中首次發現了miRNA-34a 的存在，到目前為止miRNA-34a 已經成為研究最多的miRNA 之一[9]。miRNA-34b/c 位于人類11 號染色體的同一個區域，miRNA-34c 的表達水平與miRNA-34b 的表達嚴格平行。He 等[10]研究表明，miRNA-34s作為p53 的直接轉錄靶點在阻滯細胞周期進程和促進凋亡過程中扮演重要角色，因此提高miRNA-34s在癌癥中的表達有望成為惡性腫瘤新的治療方式。

2 miRNA-34s 在腫瘤發生過程中的作用機制

2.1 p53 對miRNA-34s 的正向調控

miRNA-34s 主要受p53 的直接調控從而在組織和細胞中發揮作用，最終導致細胞周期停滯、細胞凋亡或衰老。當細胞受到某些刺激，如DNA 損傷、藥物刺激等，p53 基因被激活以應對外來刺激。p53 被激活后作用于下游的多個效應器發揮腫瘤抑制作用，其中miRNA-34s 被認為是p53 復雜網絡通路中的中心效應分子[11-12]。p53 通過作用于miRNA-34s 上游啟動子區域內的“p53 反應元件”對其表達進行調控，隨后miRNA-34s 的種子序列與其靶mRNA 的3′UTR 以不完全堿基配對的形式結合，從而對下游靶基因產生負性調控作用，其中主要調控多種與腫瘤發生相關的細胞周期基因或癌基因，如細胞周期蛋白D1（CCND1）、細胞周期蛋白E2（CCNE2）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）、沉默信息調節因子（SIRT）、MET、E2F3、Bcl-2、MYC，從而誘導G0/G1期阻滯和腫瘤細胞凋亡以發揮抑癌作用[13]。

2.2 miRNA-34s 對p53 的正反饋激活

miRNA-34s 通過抑制多個下游靶基因的表達從而對p53 產生正反饋激活作用。Yamakuchi 等[14]研究發現，在結腸癌細胞中，miRNA-34a 通過調節沉默信息調節因子1（SIRT1）間接調控p53。SIRT1 是一種NAD 依賴性脫乙酰酶，在氧化應激和遺傳毒性刺激下調節細胞凋亡。SIRT1 使p53 產生乙酰化效應，限制p53 對其下游靶基因的反式激活能力。miRNA-34a高表達抑制了SIRT1 對p53 的去乙酰化作用，導致乙酰化p53 的增加，同時p53 另外的轉錄靶點——p21、PUMA 的表達也增加。總之SIRT1 介導miRNA-34a和p53之間形成正反饋環[15]。另外，E2F3 作為miRNA-34a 的調控靶點參與到對p53 的正反饋激活的另一通路中。E2F3 屬于E2F 家族，通過調控細胞周期和影響DNA 的合成速度參與細胞生長和分化過程。miRNA-34a 通過對E2F3 的抑制從而作用于p53調節網絡形成p53-miRNA-34s 正反饋環[16]。miRNA-34s 還作為中間分子連接了p53 和Wnt 兩大信號通路，證實了腫瘤抑制功能喪失與癌基因信號激活之間存在緊密聯系[17]。

2.3 miRNA-34s 與衰老

miRNA-34s 具有誘導腫瘤細胞凋亡、細胞周期停滯和衰老的作用。衰老是一種細胞應激反應，導致細胞永久性的增殖停滯，相關基因誘導的衰老過程是體內腫瘤發生的一個重要阻礙[18]。Vogt 等[19]及Christoffersen等[20]研究發現，miRNA-34a 在基因B-RAF 誘導衰老的這一過程中表達上調，這是由ETS 轉錄因子家族的ELK1 介導的，獨立于p53 的新途徑。其中基因MYC作為這一過程中miRNA-34a 的直接轉錄靶點，其表達受到抑制，從而導致一整套有絲分裂基因表達的下調，最終導致了miRNA-34s 抑制細胞增殖從而引起細胞衰老的效應。

2.4 miRNA-34s 與腫瘤干細胞

除此之外，miRNA-34s 還參與到腫瘤干細胞自我更新過程的調控中。腫瘤干細胞是一類能夠自我更新和分化的細胞亞群，目前在多種腫瘤組織中都發現了腫瘤干細胞的存在，其被證實可能導致了腫瘤的發生、發展、轉移和治療的抵抗[21]。據以往對胰腺癌和胃癌中腫瘤干細胞的研究，miRNA-34a 通過靶向Notch、HMGA2 和Bcl-2、C-Met 等基因參與腫瘤干細胞的自我更新和生存，并在細胞命運決定中發揮重要作用[22]。在胰腺癌細胞中，miRNA-34s 在翻譯水平下調了靶基因Notch1、Notch2、Bcl-2 的表達，顯著抑制克隆性細胞的生長和侵襲，誘導細胞凋亡和G1、G2/M期阻滯，并且使腫瘤細胞對放化療敏感[23]。

3 miRNA-34s 在宮頸癌中的調控機制

持續性的高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染已被證實是宮頸癌發生的重要病因之一，其機制在于HR-HPV 編碼的E6、E7 癌蛋白通過滅活p53 和Rb腫瘤抑制基因調控腫瘤細胞的粘附、凋亡過程以及改變細胞周期進程，從而促進細胞轉化和永生化[24]。miR-34a 作為p53 激活后最顯著的miRNA 誘導物在宮頸癌的調控中發揮不容忽視的作用[25]。Li 等[26]研究發現，HPV 感染和宮頸癌患者病變組織中miR-34a的表達減少。HR-HPV E6 癌蛋白主要以p53 依賴的途徑介導miR-34a 表達減少，并且隨著宮頸病變的逐級進展，miR-34a 的表達水平逐級下降。在HR-HPV感染的宮頸組織中，miR-34a 表達降低可能發生在宮頸上皮細胞的形態學改變之前，因此可以通過測定組織中miR-34a 的表達來提早干預宮頸病變的發生過程。宮頸癌的發生是一個由癌前病變向浸潤性宮頸癌逐漸發展的過程，而miR-34a 表達減少作為宮頸癌眾多分子改變中的早期事件，可能是預測宮頸組織HPV感染結局和區分高、低級別鱗狀上皮內病變的一個有價值的生物標記物，并且將有助于對HPV 陽性的婦女進行分流，提高臨床工作中HPV 病毒基因檢測的特異性[27-28]。miR-34a 通過調控細胞生命過程中的眾多分子發揮其生物學功能，多數時候不同靶點之間的效應產生疊加增強了miR-34a 在宮頸癌中的抑癌作用[15]。

3.1 miR-34a 與細胞周期調控

E2F3 是公認的細胞周期調控因子，它能夠促進宮頸癌細胞中的G1/S 期轉變，且在宮頸鱗狀上皮內病變和宮頸癌中均表達上調，同時E2F3 又是HPV 陽性宮頸癌細胞中miR-34a 的直接靶點，miR-34a 通過在翻譯水平上直接抑制E2F3 的表達調節癌基因survivin，降低了HPV 陽性宮頸癌細胞的生存能力和侵襲力，發揮抑癌作用[29]。

3.2 miR-34a 與細胞增殖、遷移及侵襲

通常以腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲特性來衡量腫瘤細胞轉移能力的高低。高遷移率族蛋白盒1（HMGB1）是一種在人類宮頸癌細胞中高表達的核蛋白，在受到損傷攻擊后被釋放出來激活機體的免疫反應。Chandrasekaran 等[30]的一系列體內體外實驗表明，HMGB1 是miR-34a 在宮頸癌細胞中的直接作用靶點。miR-34a 在體外過表達以及下調其內源性的表達都會影響細胞增殖，而下調HMGB1 的表達會產生與miR-34a 過表達同樣的抗增殖效應，由此得出miR-34a可以通過介導HMGB1 的下調對宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲產生不利影響，從而促進腫瘤發生轉移。

3.3 miR-34a 與宮頸癌中的上皮-間充質轉化（EMT）程序

除了持續的HR-HPV 感染外，Wnt1/β-catenin 途徑的激活是誘導宮頸癌發生的另一個催化劑。與正常宮頸組織相比，Wnt1 在宮頸鱗癌中過表達并對其預后產生不良影響，若使Wnt1 低表達會通過抑制Wnt1/β-catenin 這一反應通路，進而抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[31]。在宮頸鱗狀細胞癌中，miR-34a直接靶向Wnt1 抑制Wnt1/β-catenin 通路的信號轉導，導致E-鈣粘蛋白上調和P-鈣黏蛋白下調，以及總β-連環蛋白和核β-連環蛋白表達下調，并通過調節Ecadherin-to-P-cadherin 開關（E-P 開關）抑制宮頸癌的EMT 過程，最終抑制腫瘤的生長和侵襲。下調內源性HPV-16e6/E7 的表達導致miR34a 表達上調和WNT1 表達下調，提示HPV-16e6/E7 可能參與了宮頸鱗癌細胞中miR-34a 和Wnt1 表達的調控過程[32]。

3.4 miR-34a 的其他生物學機制

miR-34a 通過調節宮頸癌細胞中乳酸脫氫酶A（LDHA）的表達調節有氧糖酵解（Warburg）效應，從而在腫瘤代謝水平抑制宮頸癌的進展[33]。NLRC5 是Nod樣受體（NLR）家族的一個新成員，其參與調節抗病毒免疫反應。NLRC5 的在組織中的下調可能是HRHPV 干擾宿主防御系統，從而促進其持續感染的一種獨特機制。miR-34a 通過拮抗NLRC5 的表達，從而參與到宮頸癌的免疫過程中[34]。由此可得，miR-34a與宮頸組織中HR-HPV 感染的持久性存在顯著相關性。癌基因C-Met 編碼肝細胞生長因子（HGF）的生長因子受體，顯示酪氨酸激酶的活性，并誘導上皮細胞的運動、增殖和侵襲。Bcl-2 是最重要的抗凋亡蛋白之一，參與腫瘤的發生和抗腫瘤藥物的耐藥。miR-34a通過靶向Bcl-2 和C-Met 發揮其作為宮頸癌侵襲性進展和預后不良的生物標記物的作用[35-36]。miR-34a還與同為非編碼RNA 中一員的LncRNAs 發生相互作用。LINC00473 在宮頸癌中起到癌基因的作用，miR-34a 直接與LINC00473 結合，并作為LINC00473 介導的細胞增殖的負性上游調節因子調節宮頸癌的增殖[37]。另外LncRNA-MACC1-AS1 可能通過海綿miR-34a，部分解除了miR-34a 對CDK6 轉錄后抑制的靶向作用，促進了SiHa 細胞增殖和細胞周期進程[38]。

3.5 血液中的miR-34s

miRNA 在人類血液中穩定表達，因此可以通過檢測血液中的miRNA 進行疾病的診斷、分級和評估預后。相比較于檢測腫瘤組織中的miR-34a，通過檢測血漿miR-34a 診斷腫瘤有許多優點：微創性、可重復性，且簡單易行。宮頸癌患者血漿中miR-34a 的表達水平與腫瘤組織中的miR-34a 表達呈正相關，并且兩者的表達水平均與宮頸病變的嚴重程度相關，這使得通過檢測血漿中的miR-34a 對宮頸癌進行診斷、病變分級和預后評估成為可能[39]。

Sommerová 等[40]和Cao 等[41]研究 證實，miR-34b、miR-34c 同樣在宮頸癌發生發展過程中起潛在的抑制作用。miR-34b 通過調節轉化生長因子-β1（TGFβ1）抑制細胞遷移，誘導細胞凋亡。miR-34c 的過表達抑制SiHa 細胞的增殖、遷移、侵襲和促進細胞凋亡。

4 小結

miRNA-34 家族各成員在宮頸癌中與眾多功能各異的靶點相互作用，組成了宮頸癌調控網絡中龐大的一部分，并且有望成為宮頸癌潛在的病變分級指標、診斷和預后標記物以及重要的治療靶點。miR-34s在多種腫瘤特別是宮頸癌治療中的廣泛應用前景不容忽視。