犬體內(nèi)兩種人獸共患棘口吸蟲的分子鑒定

邱鴻宇，蘭卓，果馨儒，吳婷婷，姜巖，金程佳，張曉軒，王春仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

棘口吸蟲為棘口科（Echinostomatidae）吸蟲的統(tǒng)稱，種類較多，包括棘口亞科（Echinostomatinae）、棘隙亞科（Echinochasminae） 等11 個亞科，棘口屬（Echinostoma）、棘隙屬（Echinochasmus）、似頸屬（Isthmiophora）等51 個屬的蟲體600 多種，這類吸蟲主要寄生于哺乳類和鳥禽類，大約有20 多種可以感染人[1-3]。日本棘隙吸蟲（Echinochasmus japonicus）和圓圃似頸吸蟲（Isthmiophora hortensis，圓圃棘口吸蟲（Echinostoma hortensis）的同物異名就是其中重要的種類。日本棘隙吸蟲主要終末宿主為犬和貓，還感染雞、鴨等家禽及白鷺等野生鳥類，鼠類和食蟲動物也可成為其自然終末宿主，淡水螺和淡水魚為其第一中間宿主和補(bǔ)充宿主，主要流行于中國、日本、韓國、科威特、老撾、俄羅斯、泰國和越南等地[3-7]。圓圃似頸吸蟲的終末宿主為犬和貓，豬和鼠類也有感染的報(bào)道，第一中間宿主也是淡水螺，泥鰍和蛙為其第二中間宿主，主要流行于中國、日本、韓國[3-4，8-10]。兩種蟲體均寄生于宿主的腸道中。動物是因采食生的淡水魚蛙而獲感染，感染后的主要癥狀集中在消化系統(tǒng)，如腹瀉、腹痛、食欲不振等，重度感染可見腸黏膜出血、腸炎，導(dǎo)致脫水，嚴(yán)重者可引起死亡，對犬貓飼養(yǎng)影響很大[1-3]。同時，兩種吸蟲均可以感染人，具有重要的公共衛(wèi)生意義[3-4]。

寄生蟲的準(zhǔn)確鑒定是寄生蟲病防控和科學(xué)研究的基礎(chǔ)，過去對寄生蟲的分類鑒定主要依賴于形態(tài)學(xué)方法，但這種方法對于形態(tài)相似的蟲體存在一定的局限性。棘口吸蟲不僅種類繁多，而且很多種類形態(tài)相似，同一屬內(nèi)，甚至同一亞科內(nèi)的蟲體也很相似。頭棘的數(shù)量和排列是棘口科吸蟲鑒定的一種重要標(biāo)志，然而同一屬中的不同種的頭棘數(shù)量也不盡相同，不同屬間頭棘的數(shù)量也有相同的，這就大大地增加了鑒定的難度。可以這樣講，棘口科吸蟲是吸蟲中最難準(zhǔn)確鑒定的類群之一，然而分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。試驗(yàn)以采自黑龍江省自然感染犬體小腸內(nèi)的兩種棘口吸蟲為研究對象，用PCR 方法擴(kuò)增其核糖體DNA 中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列，并與GenBank 上公布的相關(guān)棘口吸蟲ITS 序列進(jìn)行對比分析和進(jìn)化分析，鑒定吸蟲的種類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源

蟲體來自黑龍江某地自然死亡的犬只，剖檢時在小腸內(nèi)檢出蟲體8 條，清洗后保存于70%的乙醇中，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

顯微鏡，載玻片，蓋玻片，移液管，鑷子，挑針，DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit），Ex Taq DNA 聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），r Taq DNA 聚合酶（TaKaRa），pMD18-T 載體（TaKaRa），大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa），DNA Marker（2000），1×TAE，蛋白酶K，生理鹽水，75%乙醇，瓊脂糖，溴化乙錠，DNA 凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit），甘油，冰乙酸，去離子水等實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)初步觀察

因犬死亡時間較長，送檢較晚，蟲體破損較為嚴(yán)重，無法制作裝片進(jìn)行仔細(xì)觀察。于是將收集到的蟲體用蒸餾水反復(fù)洗滌后，直接置顯微鏡下進(jìn)行觀察。依據(jù)蟲體大小和外部形態(tài)，初步斷定是兩種吸蟲，分別命名為吸蟲A 和吸蟲B。在不同倍數(shù)不斷調(diào)整蟲體位置來觀察蟲體外觀及內(nèi)部各器官的形態(tài)特征。

1.2.2 總DNA 提取

將兩種吸蟲清洗后，用TIANamp Genomic DNA Kit（TIANGEN）試劑盒嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行DNA 提取，提取后DNA 分裝置于－20 ℃冰箱中保存，用于下一步PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增

以兩種蟲體DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增蟲體ITS 序列，使用Gasser 等[11]設(shè)計(jì)的通用引物，上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由哈爾濱擎科生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，1 μL DNA 模板，2.5 μL Ex Taq Buffer，2 μL dNTP mixture，0.5 μL 引物和0.2 μL Ex Taq DNA 酶。具體的擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入循環(huán)：98 ℃變性30 s，退火溫度55 ℃30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增出的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照。切下目的條帶后用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。然后將回收的DNA 產(chǎn)物連接到T-easy 載體上，經(jīng)過無抗LB 培養(yǎng)后，涂在AMP+的固體LB 培養(yǎng)基上，克隆所得陽性質(zhì)粒送到哈爾濱擎科科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析與進(jìn)化關(guān)系分析

測序得到的序列經(jīng)拼接后，應(yīng)用DNAStar 軟件中的MegAlign 與棘口科的相關(guān)蟲體進(jìn)行同源性分析。利用MEGA X 軟件，基于rDNA ITS2 序列，以肝片吸蟲為外群，采用最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）將研究的兩種蟲體與棘口科13 屬29 種吸蟲構(gòu)建進(jìn)化樹，來探討這兩種吸蟲與其它棘口吸蟲之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體形態(tài)學(xué)初步觀察

吸蟲A：吸蟲A 一共5 條蟲體，蟲體扁平，外觀整體呈瓶狀，有口腹兩吸盤。體長1.03~1.04 mm，體最寬0.33~0.38 mm。有頭部24 棘，背部中間無棘，左右各12 枚。口吸盤位于蟲體前端，腹吸盤位于蟲體前1/2 處。睪丸呈橢圓形，前后排列于蟲體后1/3 處。卵巢看不清楚。參照相關(guān)文獻(xiàn)[1]初步鑒定為棘口科棘隙屬吸蟲。

吸蟲B：吸蟲B 一共3 條蟲體，蟲體呈長葉形，有口腹兩吸盤。體長8.6~9.1 mm，體最寬1.2~1.3 mm。有頭棘27 枚，8 枚腹角棘平分，左右各4 枚。口吸盤位于蟲體前端，腹吸盤在蟲體前1/5 處，大于口吸盤。睪丸呈類橢圓形，前后排列于蟲體中部。卵巢形狀不清，卵黃腺分布于蟲體兩側(cè)數(shù)量較多。參照相關(guān)文獻(xiàn)［1，9］初步鑒定為棘口科似頸屬吸蟲。

2.2 目的基因的擴(kuò)增

成功擴(kuò)增兩種蟲體的ITS 序列，分別在1 300 bp和1 000 bp 左右出現(xiàn)明顯條帶，大小在目的基因范圍之內(nèi)，條帶單一且明亮（圖1）。

圖1 兩種吸蟲ITS 序列的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of ITS sequence of two trematodes

2.3 序列分析與進(jìn)化分析

經(jīng)鑒定的陽性質(zhì)粒送至哈爾濱擎科生物有限公司進(jìn)行測序，拼接后得到長度分別為1 233 bp 和1 046 bp 的ITS 序列。吸蟲A 的ITS1 長度為386 bp，A+T 含量為49.48%，5.8 S 長度為156 bp，A+T 含量為45.51%，ITS2 長度為691 bp，A+T 含量為47.47%，ITS 全序列A+T 含量為47.85%。經(jīng)MegAlign 同源性序列分析比較發(fā)現(xiàn)，該蟲體與GenBank 上已經(jīng)發(fā)表棘口科冠孔屬（Stephanoprora）、棘口屬（Echinostoma）、棘緣屬（Echinoparyphium）、真緣屬（Euparyphium）和似頸屬（Isthmiophora） 的同源性較低，在76.4%~82.9%之間；與同屬蟲體同源性較高，與Echinochasmus coaxatus 同源性為96.4%，而與來自越南的日本棘隙吸蟲（KT873314.1）同源性高達(dá)99.5%。吸蟲B 的ITS1、5.8 S 和ITS2 的大小分別是444、162 bp 和440 bp，A+T 含量分別是46.62%、47.53%和50.00%，ITS 全序列A+T 含量為48.18%。同源性分析顯示與冠孔屬、棘緣屬、真緣屬和棘隙屬的同源性在74.9%~89.4%之間，與棘口屬的Echinostoma caproni 的同源性僅為84.8%，但與來自黑龍江淡水魚圓圃棘口吸蟲囊蚴（KX832896.1） 和來自日本浣熊的圓圃似頸吸蟲（AB189982.1）ITS2 序列同源性均為100%。

基于ITS2 序列，棘口科13 屬29 種吸蟲構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，整個棘口科吸蟲形成兩個大的分支，棘隙屬蟲體與冠孔屬蟲體形成一個大分支，棘口屬及其它屬吸蟲形成另一大分支。在棘隙屬與冠孔屬這一大分支中，棘隙吸蟲又單獨(dú)形成一個小的分支，實(shí)驗(yàn)吸蟲A 與來自越南的5 條日本棘隙吸蟲聚集在一起，親緣關(guān)系較另一種棘隙吸蟲（Echinochasmus coaxatus）近。值得注意的是，吸蟲B 并未與除圓圃棘口吸蟲外的其他棘口屬吸蟲聚集在一起，而是與圓圃棘口吸蟲、Isthmiophora hortensis 聚集在一起，與獾似頸吸蟲（Isthmiophora melis）形成一獨(dú)立分支（圖2）。

圖2 基于ITS2 序列構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on ITS2 sequences

因此，基于序列分析和進(jìn)化分析，鑒定兩種吸蟲分別為日本棘隙吸蟲和圓圃似頸吸蟲。

3 討論

日本棘隙吸蟲和圓圃似頸吸蟲感染的動物主要是犬和貓，因這些動物不是影響畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的主要動物，所以人們關(guān)注和重視的程度不高。然而感染的犬和貓是人類感染的重要傳染源，在疫病的流行中起到非常重要的作用。人是因?yàn)槭秤蒙幕蛭粗笫斓牡~和蛙類（蛙類僅為圓圃似頸吸蟲的中間宿主）而感染。目前，世界上很多國家有人感染的病例報(bào)道，如中國、韓國、日本、泰國、老撾、越南等[3-7，12-15]，可以看出這些國家主要集中在東南亞，這可能與人們的生活飲食習(xí)慣有關(guān)，這些地區(qū)的人們都吃生淡水魚的習(xí)慣。在我國，雖然同樣因吃生魚而感染華支睪吸蟲的患者廣泛分布于27 省區(qū)[16]，但日本棘隙吸蟲僅在福建、廣東、廣西、江蘇、安徽等地有人感染的報(bào)道[5，12，17-20]，圓圃似頸吸蟲僅在廣西、遼寧、貴州和黑龍江有報(bào)道[21-24]。分析可能是由于該蟲體寄生于小腸，蟲體較小，人體感染強(qiáng)度通常又比較低，癥狀比較輕微，而且很少有人在沒有寄生蟲感染跡象時進(jìn)行寄生蟲蟲卵檢查，即使感染了，也很可能會被遺漏，估計(jì)實(shí)際感染的省份和病例遠(yuǎn)不止這些。雖然在黑龍江省多地犬小腸內(nèi)檢出日本棘隙吸蟲[25]，同時在魚吸蟲囊蚴檢查時，也發(fā)現(xiàn)了大量日本棘隙吸蟲囊蚴，而且感染魚的種類多，地理分布較廣，黑龍江省卻還未見人感染的報(bào)道。盡管成年人少量感染棘口吸蟲不能造成直接死亡，但由于頭棘造成腸道損傷，易繼發(fā)細(xì)菌感染，再加之毒素作用，對人的危害也不容忽視。幼兒和兒童大量感染可產(chǎn)生嚴(yán)重后果，江蘇有一17 月齡患兒因寄生207 條日本棘隙吸蟲引起長期腹瀉，導(dǎo)致患兒重度營養(yǎng)不良并發(fā)念球菌感染，全身衰竭而死[19]。桂林也有一例5 歲男孩因大量感染日本棘口吸蟲而死亡的報(bào)道[17]。因此，建議對棘口吸蟲應(yīng)足夠重視，在條件允許情況下，對于有吃生魚蛙史的人們，特別是采取生吃泥鰍偏方治病者，應(yīng)定期進(jìn)行糞便檢查，發(fā)現(xiàn)蟲卵，及時驅(qū)蟲，以保證身體健康。

由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的局限性，以核糖體和線粒體為標(biāo)記基因來鑒定蟲體得到了廣泛應(yīng)用。其中應(yīng)用最多的就是ITS 序列，ITS 序列是18S 和28S 之間的區(qū)域片段，包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2），核糖體DNA 中的ITS1 和ITS2片段是非編碼區(qū)，不轉(zhuǎn)錄成RNA，進(jìn)化選擇壓力小，相對變化較大，在種間有較大的差異，所以可以作為鑒定近緣種與種群的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的標(biāo)記基因[26]。Huang 等[27]在對來自不同地區(qū)的肝片吸蟲和大片吸蟲ITS 序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了一種介于兩者之間的“中間型”，目前“中間型”片形吸蟲已得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可；高遠(yuǎn)等[28]通過對鼻形杯環(huán)線蟲ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增和比對分析，準(zhǔn)確地鑒定了該蟲體；羊仰口線蟲和牛仰口線蟲兩者形態(tài)比較相似，特別是雌蟲，為了從分子水平上鑒別兩種蟲體，Wang 等[29]使用限制性內(nèi)切酶Nde I 對兩種線蟲核糖體ITS 進(jìn)行酶切，結(jié)果羊仰口線蟲被切成兩段，而牛仰口線蟲不變，建立了區(qū)分兩種線蟲的PCR-RFLP 方法。ITS 序列不僅可以鑒定成蟲，還可以鑒定吸蟲囊蚴，華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲囊蚴均寄生于魚的肌肉，形態(tài)十分相似，很難通過形態(tài)學(xué)加以區(qū)分，我們團(tuán)隊(duì)以ITS 為標(biāo)記基因建立了區(qū)分兩種吸蟲囊蚴的PCR-RFLP 方法，并獲批了發(fā)明專利[30]。

日本棘隙吸蟲與藐小棘隙吸蟲等同屬的大部分吸蟲均為24 個頭棘，大小相似；圓圃似頸吸蟲和獾似頸吸蟲（Isthmiophora melis）、真緣屬的隱棘真緣吸蟲（Euparyphium inerme）均有27 枚頭棘，大小也差不多，形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確鑒定需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，難度較大，特別是當(dāng)蟲體形態(tài)受損時，形態(tài)觀察則更加困難，因此采取PCR 方法擴(kuò)增了待檢蟲體的ITS 序列，并與相關(guān)序列比較分析，同時構(gòu)建了分子進(jìn)化樹來鑒定這兩種蟲體。序列分析發(fā)現(xiàn)，吸蟲A 與GenBank 公布的日本棘隙吸蟲（KT873311.1）同源性為99.5%。基于ITS 序列構(gòu)建的棘口科吸蟲進(jìn)化樹顯示，吸蟲A 與棘隙屬吸蟲一起，與冠孔屬吸蟲和棘隙屬處于一個大分支上。在棘隙屬吸蟲分支中，試驗(yàn)蟲體與其來自越南的5 條日本棘隙吸蟲ITS 序列聚在一起，可以準(zhǔn)確地鑒定該蟲體為日本棘隙吸蟲。關(guān)于圓圃似頸吸蟲的分類一直有爭議，該蟲體最初由日本學(xué)者在1926年發(fā)現(xiàn)并命名為圓圃棘口吸蟲[31]。2002 年，Kostadinova 和Gibson 在對似頸屬和真緣屬進(jìn)行分類研究時，確定了這兩屬的有效性，并對相關(guān)蟲體進(jìn)行重新分類。通過對圓圃棘口吸蟲的詳細(xì)觀察，認(rèn)為該蟲體的子宮區(qū)域、睪丸位置，頭棘27 枚和不同種類棘的大小等特征更符合似頸屬特征，正式將其從棘口屬移至似頸屬，并將其重命名為圓圃似頸吸蟲（Isthmiophora hortensis）[32]，該種名已得到業(yè)界的認(rèn)可，成為有效種。但我國有的學(xué)者還使用圓圃棘口吸蟲這一名稱[24，33]。研究的序列分析也發(fā)現(xiàn)，檢出的吸蟲B與棘口屬吸蟲Echinostoma caproni 的同源性僅為84.8%，而與獾似頸吸蟲同源性為95.4%，與圓圃似頸吸蟲和圓圃棘口吸蟲同源性為100%。進(jìn)化分析顯示吸蟲B 沒有和棘口屬的吸蟲在一起，而是與圓圃似頸吸蟲處與同一分支。因此基于對吸蟲核糖體ITS序列的研究也支持圓圃棘口吸蟲應(yīng)為圓圃似頸吸蟲，研究所獲得來自于犬的蟲體為圓圃似頸吸蟲，以前我們團(tuán)隊(duì)在GenBank 上公布的來自于犬的和魚囊蚴的相關(guān)序列應(yīng)為圓圃似頸吸蟲序列，同時建議以后學(xué)者在發(fā)表學(xué)術(shù)論文和學(xué)術(shù)交流時采用圓圃似頸吸蟲來代替圓圃棘口吸蟲這一名稱。研究再次證明了ITS 是寄生蟲分子鑒定的重要靶標(biāo)。