牛糞分離液和玉米秸稈不同混合比例對厭氧發酵的影響

許從峰，趙鐸，王海鵬，申貴男，袁媛，高亞梅，魏丹，晏磊，王偉東

（1.黑龍江省寒區環境微生物與農業廢棄物資源化利用重點實驗室，黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.北京市農林科學院植物營養與資源研究所）

牛糞中經過瘤胃未消化的粗纖維占總固形物含量的50%以上，難于被厭氧微生物直接利用，致使牛糞厭氧發酵速度差異明顯，整體發酵效率低，不利于生物質能源產業的發展[1-2]。用螺旋機對糞污進行固液分離預處理，能有效減少分離液中粗纖維和COD含量，降低黏度，使其成為厭氧發酵的優勢原料，是規模化奶牛場糞便預處理的普遍措施[3-4]。

混合厭氧發酵是一種將兩種或兩種以上的發酵物料放入同一厭氧發酵裝置內進行發酵的方式，不同性質的物料混合可以為微生物提供均衡的營養物質、微量元素[5-7]，克服單一發酵原料產氣慢、發酵效率低等缺點[8-9]，是農業廢棄物資源化的研究熱點之一。厭氧發酵主要包括：水解酸化階段、產氫產乙酸階段和產甲烷階段，其中水解酸化階段是厭氧發酵的主要限速步驟[10-11]，混合物料能調節發酵起始階段底物的酸堿度，增強緩沖能力，使產氣高峰提前[12-13]。一般認為，發酵原料的C/N 在25 左右最適宜微生物的生長[14-16]，秸稈的C/N 偏高，牛糞分離液偏低，將不同物料混合能顯著改善C/N，促進木質纖維素的降解，提高發酵潛力[17]。雖然發酵原料中的碳素最終轉化為CO2和CH4，但是微生物是整個過程中主要的執行者，它的功能和活性與甲烷產量密不可分，混合發酵有助于揮發性脂肪酸的積累[18]，增加微生物多樣性，有利于厭氧發酵的進行[19]。試驗選取牛糞分離液和玉米秸稈作為原料進行厭氧發酵批次試驗，探討牛糞分離液不同添加量對分離液與玉米秸稈混合發酵產沼氣能力及纖維素、半纖維素和木質素降解效果的影響，為牛糞分離液和玉米秸稈混合厭氧發酵的研究提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用牛糞分離液取自黑龍江省安達市某牧場；玉米秸稈取自黑龍江八一農墾大學農學院試驗基地，秸稈自然風干，粉碎至約5 mm 后置于干燥處備用；接種物取自黑龍江省寒區環境微生物與農業廢棄物資源化利用重點實驗室長期運行的常溫厭氧發酵罐。原料的性質見表1。

表1 發酵原料的性質Table 1 The properties of fermentation materials

1.2 批次厭氧發酵體系建立

試驗裝置采用1 L 自制厭氧發酵瓶，瓶口處用硅膠塞密封，硅膠塞處出氣口與3 L 集氣袋相連，用于沼氣的收集。試驗采用批次厭氧發酵，設置發酵總體積為700 mL，其中接種物占總體積的50%，牛糞分離液添加量設置0、50、150、250 mL 共4 個處理（記為A 組、B 組、C 組、D 組），分別添加玉米秸稈調整總TS 為8%，發酵體積不夠用蒸餾水補齊，每個處理3個重復，共12 個處理，在（37±1 ℃）恒溫室內進行試驗，每隔24 h 手動搖瓶5 min，沼氣和甲烷產量利用GA2000 沼氣分析儀（Geotech Biogas Check）測定。

1.3 測定方法

1.3.1 總固體含量和揮發性固體含量測定

總固體含量（Total Solids，TS）和揮發性固體含量（Volatile solids，VS）：采用烘干法和灼燒法進行測定[20]，首先將待測材樣品放入電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE）中，105 ℃烘8 h 至恒重，冷卻稱重，記錄數據，然后將烘干后的樣品放入馬弗爐（KSY-6-16A）中，500 ℃灼燒3 h 至恒重，冷卻稱重，記錄數據。TS 和VS 的計算公式如下：

注：m0為坩堝重量；m1為烘干前樣品與坩堝總重；m2為烘干后樣品與坩堝總重；m3為灼燒后殘留物與坩堝總重。

1.3.2 木質纖維素含量測定

利用FIWE3/6 纖維素測定儀（北京盈盛恒泰科技有限責任公司）采用范式法（Van Soest）測定木質纖維素含量[21]。首先將發酵后的樣品置于電熱鼓風干燥箱烘干，用植物粉碎機（FZ102）粉碎至40 目，稱取1 g 樣品（精度為1 mg），置于烘干的坩堝內，根據纖維素測定儀操作手冊可測定酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌木質素（Acid detergent lignin，ADL）測定。計算方法為：纖維素含量=ADF-ADL，半纖維素含量=NDF-ADF，ADL 即為木質素含量。

1.4 數據分析

采用Excel 2010、Origin 8.1 進行數據處理和繪圖。利用SPSS.20 軟件對試驗數據進行單因素方差分析（One way ANOVA，Turkey 法）。

2 結果與分析

2.1 不同處理對日產沼氣量和累積產沼氣量的影響

如圖1 所示，所有處理組均在第1 d 達到產氣高峰，其中B 組日產沼氣量最高，為1 785 mL，D 組日產沼氣量最低，為1 410 mL，第2 d 顯著下降，第3 d開始上升，A 組、B 組、C 組、D 組分別在第5、5、4、3 d達到第二產氣高峰，高峰期日產沼氣量分別為733、783、827、793 mL，隨后一直呈下降趨勢。從圖2 所知，各處理組累積產沼氣量呈先上升后下降的趨勢，其中C 組累積產沼氣量最高，為6 283 mL，A 組累積產沼氣量最低，為5 893 mL，比C 組降低6.21%，各處理組之間累積產沼氣量差異不顯著。根據以上結果可知，牛糞分離液與玉米秸稈混合處理組相較于未添加分離液處理組能有效提前產沼氣高峰期，提高日產沼氣量，提升累積產沼氣量，隨著分離液添加量的上升，最高日產沼氣量和累積產沼氣量有所下降。

圖1 不同處理日產沼氣量Fig.1 Daily biogas yield in different treatment

圖2 不同處理累積產沼氣量Fig.2 Cumulative biogas production in different treatment

2.2 不同處理對單日甲烷含量和日產甲烷量的影響

由表2 所示，所有處理組的單日甲烷含量均呈先上升后趨于穩定，隨后下降的趨勢，A 組、B 組、C組、D 組分別在第5、6、5、4 d 達到含量最高值，依次為59.60%、60.77%、62.40%和62.30%，其中B 組單日甲烷含量僅在第9 d 顯著高于A 組，C 組單日甲烷含量分別在第2、3、4、7、8、9 d 顯著高于A 組，D 組單日甲烷含量分別在第1、2、3、4、7 d 顯著高于A 組，單日甲烷含量均值從大到小依次為C 組＞D 組＞B組＞A 組，分別為48.27%、47.55%、43.93%和42.91%，C組和D 組顯著高于A 組和B 組。牛糞分離液與秸稈混合后對單日甲烷含量最高值影響不顯著，對單日甲烷含量影響顯著。日產甲烷量的趨勢為先上升后下降（如圖3 所示），其中A 組和B 組在第5 d 達到產甲烷高峰，分別為446 mL 和484 mL，C 組和D 組在第4 d 達到產甲烷高峰，分別為481 mL 和451 mL。根據以上結果可知，牛糞分離液與玉米秸稈混合厭氧發酵能有效提前產甲烷高峰，提高日產甲烷量。

2.3 不同處理對累積產甲烷量和TS 產甲烷率的影響

從圖4 可知，各處理組累積產甲烷量趨勢呈先上升后下降，跟累積產沼氣量趨勢相同，其中C 組累積產甲烷量最高，為2 806 mL，A 組累積產甲烷量最低，為2 113 mL，比C 組降低24.69%，不同處理組累積產甲烷量大小順序為C 組＞D 組＞B 組＞A 組。如圖5 所示，各處理TS 產甲烷率的趨勢呈先上升后下降，其中A 組TS 產甲烷率最低，為106 mL·g-1，C 組TS產甲烷率最高，為134 mL·g-1，比A 組提高20.89%。牛糞分離液中含有足夠的氮源，與玉米秸稈混合后可有效調節C/N，顯著提升厭氧發酵的產甲烷效率，提高發酵潛力。

表2 不同處理單日甲烷含量Table 2 The methane content daily in different treatment

圖3 不同處理日產甲烷量Fig.3 Daily methane yield in different treatment

圖4 不同處理累積產甲烷量Fig.4 Cumulative methane production in different treatment

圖5 不同處理TS 產甲烷率Fig.5 The methane production rate of TS in different treatment

2.4 不同處理對木質纖維素降解率的影響

對不同處理木質纖維素降解率進行測定，由圖6可知，隨著牛糞分離液添加量的增加，纖維素降解率為先上升后下降趨勢，其中C 組纖維素降解率最高，達到77.39%，表明牛糞分離液與玉米秸稈適當混合有利于纖維素的降解，分離液添加量過多會抑制纖維素的降解。半纖維素降解率整體呈上升趨勢，A 組降解率最低為69.38%，D 組降解率最高，為78.85%，牛糞分離液的添加有利于半纖維素的降解，各處理組半纖維素降解率差異不顯著。木質素降解率呈先下降后上升的趨勢，其中D 降解率最高，為31.07%，C 組纖維素最低，為7.64%。木質素降解趨勢與纖維素的降解趨勢相反，可能是由于隨著分離液添加量的增加，發酵體系的C/N 不同，導致發酵過程中各處理組纖維素降解菌和木質素降解菌的比例發生變化，進而引起纖維素和木質素降解趨勢產生差異。

圖6 不同處理木質纖維素降解率Fig.6 The degradation rate of lignocellulose in different treatment

3 討論

試驗中，對發酵原料進行適當的攪拌有利于料液分布均勻，使微生物與發酵原料充分接觸，為甲烷菌提供充足的代謝底物[22]，提升甲烷產量，在實際發酵工程中，攪拌速率和攪拌時間對沼氣提升的具體影響還需進一步研究。在厭氧發酵過程中，隨著牛糞分離液添加量的增加，日產沼氣高峰提前，添加量達到150 mL 時累積產沼氣量和累積產甲烷量達到最大值，當添加量增加至250 mL 時兩者均出現下降，玉米秸稈中含有豐富的木質纖維素，其碳素含量偏高，經過固液分離預處理的牛糞分離液中含有大量的氮素，將牛糞分離液與玉米秸稈混合發酵能顯著改善C/N，促進秸稈中木質纖維素的降解和分離液中氮素的轉化，有利于提高沼氣產量，促進厭氧發酵的進行，同時分離液添加量過多可能會造成發酵體系中氮素過剩，C/N 失衡，底物中可利用營養成分不足，抑制厭氧微生物的代謝能力[23]，導致甲烷累積產量下降。試驗中各處理組累積產沼氣量差異不顯著，而累積產甲烷量差異顯著，表明添加分離液的處理通過影響甲烷含量提升了產甲烷效果。由于固液分離的工藝不同，分離液的TS 相差較大[24]，試驗牛糞分離液取自規模化奶牛場，與在實驗室進行的手動固液分離相比更接近實際生產，在實際應用中分離液的具體添加量還需考慮溫度、原料種類、分離液TS 和經濟成本等多方面因素[25]。

余少杰等[26]研究外部添加氮源對玉米秸稈厭氧發酵的影響，發現適量的氮源能有效促進木質纖維素的降解，同時氮源過多會導致發酵體系易酸化，抑制相關微生物的生長，纖維素類物質降解率下降，這與試驗研究結果相似。秸稈厭氧發酵中木質纖維素是主要的有機質來源，適當的添加氮源能促進發酵體系的營養平衡，提升細菌的豐度與多樣性，尤其是與纖維素類物質降解有關的菌株[27]，能有效加速木質纖維素的分解轉化，為甲烷菌提供足夠的代謝所需營養物質[28]。木質纖維素的降解效果是評價發酵效果的一個單純指標，我們認為厭氧發酵中涉及多種纖維素降解微生物與復雜的代謝過程，或者僅涉及少量的功能微生物參與代謝，不同發酵條件下木質纖維素降解與發酵效果的聯系還需進一步探索。

4 結論

（1）在溫度為37 ℃，發酵總體積為700 mL，接種物占總體積的50%，TS 為8%為發酵條件下，牛糞分離液添加量為150 mL 處理組累積產沼氣量和累積產甲烷量最高。

（2）牛糞分離液和秸稈混合厭氧發酵能有效促進纖維素類物質的降解，提高甲烷含量和產甲烷潛力。