ANP對胃癌MGC-803細胞增殖遷移的影響及機制的研究

朱亞清， 李春輝*， 何 濤， 劉寧寧

(1.承德醫學院附屬醫院病理科， 河北 承德 067000 2.河北省承德市中心醫院， 河北 承德 067000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。我國每年胃癌的新發病例可達世界新發病例的40%以上[2]。臨床多數患者就診時已屬進展期乃至晚期，手術無法根治，隨著精準醫學的發展，靶向治療和聯合靶向治療已成為提高腫瘤患者生存率的一個受關注的研究方向[3]。近年來發現ANP對肺癌細胞、胰腺癌細胞和多發性骨髓瘤細胞有抑制生長的作用[4]。在胃組織上也存在ANP受體。迄今關于ANP對胃癌細胞的影響以及其潛在分子機制尚未有詳細報道，本實驗擬探討ANP對人胃癌細胞株MGC-803的體外作用和聯合PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002對人胃癌細胞株MGC-803的體外作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料：低分化人類胃癌細胞株MGC-803由承德醫學院基礎醫學研究所饋贈；RPMI1640培養基(Corning)；胎牛血清(Cegrogen)；PBS(BI)；胰蛋白酶(Gibco)；ANP(Aladdin)；LY294002(Cayman)；CCK-8(美侖)；兔抗人Akt1/2/3 (Huananbio)；兔抗人P-Akt(ser473)(Affinity Biosciences)；兔抗人β-actin一抗、羊抗兔二抗均購自北京中杉生物技術公司；廣譜marker、BCA試劑盒、RIPA(附PMSF)、Westen Blot膜再生液均購自Solarbio；超敏ECL液(大連美侖)；SDS-PAGED蛋白上樣緩沖液(貝博)等。

1.2方 法

1.2.1細胞培養：人胃癌細胞MGC-803培養于10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中常規培養，1～2d換液一次，當細胞密度達70%及以上時，1∶3進行傳代培養，取對數期細胞進行實驗。

1.2.2溶液的配置:LY294002溶液的配置325μL DMSO溶液充分溶解5mg LY294002干粉，配成50mmoL/L的LY294002溶液，分裝，-20℃保存，使用前用培養基稀釋成特定的濃度。ANP溶液的配置 1623μL無菌超純水充分溶解500μg的ANP干粉，配成10～4moL/L的ANP溶液，分裝，-20℃保存，使用前用培養基稀釋成特定的濃度。

1.2.3CCK-8法:檢測ANP對細胞增殖的影響：張佳[5]等實驗發現較高濃度ANP(10-6、10-7moL/L)對胃癌細胞AGC增殖有抑制作用，故本實驗設置不同濃度的ANP組(10-5、10-6、10-7moL/L)1.2.1傳代細胞以4×104/mL的密度均勻接種于96孔板中，每孔100μL，培養24h，棄去舊的培養基，向96孔板中加入ANP儲備液處理MGC-803細胞，使終濃度分別為10-5、10-6、10-7moL/L，每個濃度均設6個復孔，同時選定6個孔設為對照組(含細胞和培養基)，另設6個空白孔(只含培養基，扣除培養基本身的OD值)。分別在培養12、24和48h后，用CCK-8試劑盒，用酶標儀檢測各孔的吸光度(OD)值。實驗需要重復三次，統計結果。檢測LY294002對細胞的增殖的影響：設置對照組(只含細胞和培養基)和不同濃度的LY294002組(10、20、30、40、50μmoL/L)。種板方法同上，培養24h后，按照分組換上完全培養基和不同濃度的LY294002完全培養基，分別在培養24h、48h和72h后，用CCK-8試劑盒，用酶標儀檢測各孔的吸光度(OD)值。實驗需要重復三次，統計結果。

分別計算ANP、LY294002對細胞生長的抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

依據以上實驗結果選細胞生長抑制率在30%～50%的10-5moL/L ANP，30μmoL/L LY294002行后續實驗。設置對照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。方法同上，檢測各組作用48h后各孔的吸光度(OD值)。實驗重復三次，求得各組平均細胞生長抑制率。

1.2.4觀察MGC-803細胞形態結構:設置對照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中，2mL/孔，培養24h，棄舊培養基，根據分組分別加入完全培養基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的完全培養基，每組設3個復孔，培養48h后，觀察各組MGC-803細胞形態結構的變化并拍照。

1.2.5細胞劃痕實驗:在6孔板背后每隔0.5～1cm橫穿過孔劃5條平行線。設置對照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中，2mL/孔，培養24h，細胞單層貼壁90%以上匯合度，移液槍頭垂直于孔板背后的橫線做劃痕，PBS洗滌3次，洗去劃下的細胞，根據分組加入無血清培養基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的無血清培養基，2mL/孔。分別在培養0、24h取樣，拍照，記錄細胞遷移情況，Image J分析計算劃痕面積。計算各組劃痕面積修復率(%)=[劃痕創傷面積(0h)-劃痕創傷面積(24h)]/劃痕創傷面積(0h)×100%，實驗重復三次，計算平均值。

1.2.6Western Blotting:同1.2.4細胞培養，培養48h后，將6孔板置于冰上，PBS洗滌3次，吸凈PBS，100μL/孔裂解液，冰上裂解60min，將細胞全部刮下轉移至EP管中，4℃，12000 r/min，15min取出EP管，移取上清至新的EP管中，并作好標記，行BCA蛋白定量。經SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，TBST洗滌1次，5%脫脂奶粉常溫封閉2h，TBST洗滌2次，一抗4℃孵育過夜(t-Akt、P-Akt、β-actin工作濃度分別為1∶1000、1∶1000、1∶3000)，TBST洗滌3次，二抗搖床上孵育2h，TBST洗滌3次，ECL試劑顯影，凝膠成像儀拍照，Image J軟件進行灰度分析。不同批次蛋白重復實驗三次，進行統計學分析。

2 結 果

表1 各組大鼠免疫組化結果(OD值)

2.1CCK8結果ANP，LY294002及ANP聯合LY294002對胃癌細胞MGC-803增殖的影響:ANP和LY294002對胃癌MGC-803細胞增殖均有抑制作用，且呈時間-劑量依賴性,見表1，2。與ANP組和LY294002組相比，ANP聯合LY294002應用對MGC-803細胞增殖的抑制作用明顯增強,見表3。

表2 不同濃度的LY294002對胃癌細胞增殖的影響

表3 ANP聯合LY294002對胃癌細胞增殖的影響

2.2MGC-803細胞形態結構的變化:顯微鏡下發現，對照組MGC-803細胞貼壁生長良好；與對照組比較，ANP組細胞貼壁生長的細胞數目減少，狀態稍差；LY294002組細胞與對照組比較，生長嚴重受限，表現為部分細胞回縮甚至破裂懸浮狀態；(ANP+LY294002)組與二者單獨應用組比較MGC-803細胞生長受限更顯著，細胞碎裂并出現異常細胞形態。見圖1。

圖1 MGC-803細胞形態的改變(×200)

2.3劃痕結果:與對照組比較，ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細胞劃痕愈合速度減慢，且ANP+LY294002組劃痕愈合速度最慢，差異有統計學意義(P<0.05),見表3，圖2。

表3 ANP和LY294002對胃癌細胞遷移能力的影響

圖2 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力變化

2.4對MGC-803細胞中t-Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表達的影響:與對照組比較，ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細胞p-Akt表達明顯降低，且ANP+LY294002組細胞p-Akt表達降低最顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。四組間細胞t-AKT蛋白的表達無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05),見表4、圖3。

表4 細胞中PI3K/Akt通路相關蛋白的表達量

圖3 免疫印跡法檢測各組細胞PI3K/Akt通路相關蛋白的表達

3 討 論

胃癌的發生與細胞的異常分化、增殖及遷移等密切相關，所以在胃癌的治療過程中抑制胃癌細胞的增殖和侵襲轉移很重要。

本實驗結果顯示ANP可抑制人胃癌細胞MGC-803的增殖，并和濃度和作用時間相關。劃痕實驗，10-5moL/L ANP作用于MGC-803細胞與對照組比較，劃痕的愈合速度變慢，這就揭示ANP可抑制人胃癌細胞MGC-803的遷移，從而抑制胃癌細胞的侵襲力。本文研究結果表明ANP可抑制胃癌細胞的生長、侵襲和轉移。ANP主要由心房肌細胞產生的多功能內源性活性多肽，在心血管系統ANP可增加血管通透性，舒張血管平滑肌，調節電解質平衡等作用[6]。高于生理劑量的ANP可抑制肺癌細胞、胰腺癌細胞和多發性骨髓瘤細胞生長，并且對正常細胞卻沒有明顯的毒副作用[4]。這使得ANP可成為一種很有開發前景的腫瘤生長抑制劑。

腫瘤細胞浸潤周圍組織及轉移生長的機制相當復雜，目前研究表明與多條細胞信號傳導通路有關。如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的增殖、轉移與PI3K/Akt信號通路的激活狀態有關[7]。Akt是PI3K/Akt信號通路上最關鍵的信號分子，因此被用于多種腫瘤的研究中[8]。本實驗CCK8實驗和劃痕實驗結果表明，用PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002抑制可以抑制MGC-803細胞的增殖和遷移。在Western Blot實驗結果揭示單用LY294002下調了人胃癌細胞株MGC-803中p-Akt的表達量，而t-AKT表達無明顯變化。單用ANP同樣下調了人胃癌細胞株MGC-803中p-Akt的表達量，而t-AKT表達無明顯變化，所以ANP抑制人胃癌細胞MGC-803增殖和遷移的機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關。

聯合靶向治療在某些腫瘤的臨床治療中可進一步改善臨床療效。在本實驗中ANP聯合LY294002對MGC-803細胞增殖、遷移的抑制作用比二者單獨應用時更為顯著。ANP聯合LY294002對MGC-803細胞中p-Akt的表達量降低比二者單獨應用時也更為顯著，而t-AKT表達無明顯變化，提示ANP和LY294002聯合應用共同對抑制PI3K/AKt通路發揮了增強作用。

綜上所述，ANP可抑制PI3K/Akt信號通路抑制人胃癌細胞MGC-803的增殖和遷移，ANP和LY294002聯合應用共同對抑制PI3K/AKt通路發揮了增效作用，為聯合靶點抑制治療胃癌提供了新的思路。不足的是本實驗從單一細胞系進行研究，并且未作動物體內的整體實驗，另外ANP對MGC-803細胞的抑制作用以及ANP聯合LY294002作用增強的原因，可能也與其他信號通路之間存在著交互作用，有待于進一步研究。