外泌體來源的環狀RNA在腫瘤診療中的價值

楊文靜， 呂麗華， 姚嘉怡， 王 皓， 張春燕， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，福建 廈門 361015）

外泌體是由多種細胞分泌的、粒徑為30～150 nm的小膜泡，存在于血液、尿液、腦脊液、唾液和乳汁等體液中。外泌體內容物廣泛，包括蛋白質、脂質和核酸[DNA、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）等][1]。circRNA是一類以共價封閉環為特征，無5'和3'末端頭尾結構，廣泛存在于真核細胞中的特殊RNA分子，與多種人類疾病的發病機制相關[2]。LI等[3]的研究結果顯示，血漿外泌體中穩定存在大量circRNA。本文對外泌體來源的circRNA在腫瘤中的生物學功能，及其作為腫瘤早期診斷和預后評估標志物的潛在應用作一綜述。

1 外泌體及其生物學功能

外泌體最早于1983年在綿羊網織紅細胞中被發現，1989年由Johnstone命名。外泌體的形成是一個連續性的過程，主要包括內吞、融合和外排，即膜內陷形成動態亞細胞結構的多囊體，多囊體有2種結局：（1）與溶酶體融合，其內的管腔狀囊泡發生降解；（2）與細胞膜融合，其內的管腔狀囊泡再次凹陷，以內出芽方式形成顆粒狀小囊泡，并被釋放入細胞外環境，即外泌體[4]。

外泌體的主要功能是在生理和病理條件下通過其內容物介導細胞間通信。另外，外泌體在凝血、抗原提呈、免疫調節和病毒復制等方面也發揮了一定作用。外泌體內容物，如蛋白質、mRNA、miRNA等被證實可在受體細胞中起作用，從而激活多種信號通路[5]。腫瘤細胞可比正常細胞分泌更多的外泌體，且內容物有一定差異，腫瘤細胞來源的外泌體可為腫瘤的發展提供合適的微環境，如細胞增殖、血管生成和轉移、耐藥及轉移前微環境的形成[6]。

2 circRNA及其生物學功能

circRNA和線性RNA都起源于前體mRNA，但是與經典剪接產生的線性RNA相反，circRNA通常是通過反向剪接形成的。circRNA源自基因組的所有區域，包括基因間、內含子、反義和非翻譯區。根據其來源，circRNA可分為三大類：外顯子circRNA、外顯子-內含子circRNA和環狀內含子RNA。由于circRNA具有共價閉環的特殊化學結構，因此不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩定[2]。

circRNA起初被認為是由剪接錯誤而產生的無功能的副產物。隨著高通量測序技術和生物信息學研究的發展，在哺乳動物細胞中發現大量circRNA，充分表明其具有結構穩定、高度保守、表達量豐富的特征[7]。circRNA的主要生物學功能包括：（1）競爭性結合miRNA，調控靶基因表達；（2）與RNA結合蛋白相互作用，調控基因表達；（3）調節基因轉錄或剪接；（4）翻譯蛋白質；（5）調節表觀遺傳。有研究結果顯示，circRNA與多種人類疾病的發病機制相關，包括神經系統疾病、心血管疾病、類風濕性關節炎和糖尿病等。circRNA在腫瘤生長、轉移、干性和治療抗性中起關鍵作用，可作為癌癥診斷和預后的生物標志物[8]。

3 外泌體circRNA在腫瘤中的生物學功能

外泌體參與了腫瘤轉移前微環境和腫瘤微環境的形成。另外，通過介導免疫抑制和免疫監視，外泌體與腫瘤復發和腫瘤細胞的存活相關[9]。LI等[3]發現多種癌細胞系（結腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和宮頸癌）衍生的外泌體中穩定存在著大量circRNA，并可在患者血清、尿液和腫瘤組織中被檢測到。已有大量研究證實circRNA可能與惡性腫瘤的發生、發展有關，可調控細胞增殖、腫瘤轉移以及化療藥物耐藥，見表1。

3.1 調控腫瘤細胞增殖

增殖失調是腫瘤轉化中重要的因素之一，因此細胞周期的調控機制日益受到關注。近年來，越來越多的外泌體circRNA在各類癌癥中調控腫瘤細胞增殖的作用被揭示。如：外泌體來源的circRASSF2可促進喉鱗狀細胞癌的進展，與對照組相比，在腫瘤組織中circRASSF2的表達顯著且持續增加，下調外泌體circRASSF2通過miRNA-302b-3p/IGF-1R軸可顯著抑制細胞增殖[10]。

長期暴露于亞砷酸鹽會誘導人肝上皮細胞（L-02）發生惡性轉化，并引起circ_100284過度表達，circ_100284可能會通過外泌體從轉化的L-02細胞轉移到正常細胞中。在正常細胞中，外泌體circ_100284通過與miRNA-217相互作用，加速了細胞周期并促進細胞增殖。這表明外泌體circRNA在細胞間的通信中起信使的作用，并提示了亞砷酸鹽誘導的致癌機制[32]。外泌體circDB在高體脂率的肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中上調，脂肪細胞分泌的外泌體circDB可通過抑制miRNA-34a并激活USP7/Cyclin A2信號通路，調節HCC中的去泛素化，從而促進細胞生長并減少DNA損傷[11]。

在結直腸癌中，circIFT80通過進入外泌體促進結直腸癌的發展，通過miRNA-1236-3p/HOXB7軸，促進DNA合成和抑制細胞凋亡[12]。結直腸癌患者血清外泌體中circFMN2呈高表達并與miRNA-1182水平呈負相關，circFMN2與miRNA-1182結合可顯著促進結直腸癌細胞增殖，這提示外泌體circFMN2在促進結直腸癌腫瘤生長中起重要作用[13]。

此外，外泌體來源的circNRIP1作為miRNA-149-5p的海綿，可影響AKT1/mTOR信號通路，并促進胃癌細胞增殖[14]；外泌體來源的circ_0044516作為miRNA-29a-3p海綿，可促進前 列腺癌細胞增殖[15]。

表1 外泌體來源的circRNA在腫瘤中的生物學功能

3.2 調控腫瘤侵襲和轉移

外泌體可介導原發性腫瘤部位和遠處轉移部位之間的分子通訊及物質轉移，通過調節包括上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在內的一系列細胞活動，外泌體在腫瘤細胞的轉移和侵襲中起重要作用[33]。

WANG等[16]發現外泌體circPTGR1有助于HCC的轉移，circPTGR1的高表達與臨床分期和預后有關，敲除外泌體circPTGR1的表達顯著抑制了腫瘤在非轉移和低轉移細胞系中的侵襲和轉移。外泌體circPTGR1還可與MET相互作用，靶向競爭miRNA449a，從而導致腫瘤微環境失調，并促進HCC的發展。外泌體circ_100338參與了HCC中血管生成和轉移的調控，與HCC的進展密切相關[17]。此外，過表達circCdr1as的HCC細胞可通過外泌體的傳遞加速周圍正常細胞的增殖和轉移能力[18]。

外泌體circRNA與胃癌的相關研究結果顯示，circNRIP1可通過外泌體在胃癌細胞之間傳遞，并作為miRNA-149-5p海綿影響Akt1/mTOR信號通路，從而促進胃癌細胞轉移[14]。circRanGAP1在胃癌患者癌組織和血漿外泌體中均顯著上調，該分子通過miRNA-877-3p/VEGFA軸可增強胃癌細胞的轉移和侵襲能力[19]。最新的研究結果[20]顯示，來自胃癌細胞的外泌體將ciRS-133傳遞到前脂肪細胞中，通過激活PRDM16和抑制miRNA-133來促進前脂肪細胞向褐色樣細胞分化；進一步敲低ciRS-133可使小鼠的癌癥惡病質明顯減少，提示外泌體傳遞的ciRS-133參與了白色脂肪組織褐變并在癌癥相關惡病質中起關鍵作用。

某些外泌體circRNA的表達在胰腺癌的進展和轉移中起重要作用。LI等[21]發現外泌體circPED8A在胰腺癌組織中呈高表達，且與淋巴管浸潤、TNM分期和低生存率有關，circPDE8A可通過上調MET（上皮性腫瘤的關鍵癌基因之一）來促進腫瘤細胞的生長。此外，腫瘤細胞分泌的circPDE8A可通過外泌體被釋放到血液循環中，作為miRNA-338海綿調節MACC1，并通過MET/絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）或蛋白激酶B途徑促進侵襲性轉移。此外，還有學者[22]發現由胰腺癌細胞分泌的外泌體中的circIARS在胰腺癌組織中廣泛表達，其表達水平與肝轉移、血管侵犯和TNM分期呈正相關（肝轉移：P=0.011；血管侵犯：P=0.020；TNM：P=0.023）。CircIARS可通過衍生自胰腺癌細胞的外泌體進入人微血管靜脈內皮細胞，下調miRNA-122和緊密連接蛋白-1（zonula occludens 1，ZO-1）的水平，上調RhoA和RhoA-GTP的水平，增加F-肌動蛋白的表達和黏著斑，使內皮單層通透性增加，促進腫瘤的侵襲和轉移。

CHEN等[23]分離了膀胱尿路上皮癌患者血清和尿液中的外泌體，結果顯示，這些外泌體中的circPRMT5均顯著上調，circPRMT5可充當miRNA-30c海綿，通過circPRMT5/miRNA-30c/SNAIL1/E-鈣黏蛋白1途徑促進EMT。有研究結果顯示，血清和尿液外泌體中高表達的circPRMT5與淋巴結轉移和晚期腫瘤進展呈正相關（P＜0.05）。在卵巢癌中，外泌體通過轉移circPUM1和circWHSC1，作用于腹膜間皮細胞，從而促進腫瘤轉移[24-25]。除此之外，結直腸癌[12，26]、膽管癌[27]相關研究也發現了外泌體circRNA促進腫瘤侵襲和轉移的作用。

3.3 調控腫瘤化療耐藥

對化療藥物耐藥是腫瘤治療的巨大障礙。有研究結果顯示，外泌體可在癌細胞之間傳遞耐藥性[34]，其內容物circRNA在化療耐藥傳遞中的重要作用也逐漸被揭示。LI等[28]的研究結果顯示，與對照組相比，小細胞肺癌組血清外泌體FLI1外顯子circRNA（FECR1）異常上調，且與患者低生存率相關。circCdr1as參與了卵巢癌順鉑耐藥的形成，作為miRNA海綿下調miRNA-1270，而SCAI是miRNA-1270的靶基因，可增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。順鉑耐藥組的血清外泌體circCdr1as與順鉑敏感組相比異常下調，且circCdr1as的表達水平與miRNA-1270的表達水平呈顯著負相關（r=-0.679，P=0.000）[29]。由此可見，外泌體circRNA失調與化療藥物耐藥之間可能存在一定的聯系。

外泌體circRNA在調節化療藥物耐藥中發揮著重要作用。circ_0000338是來自FCHSD2基因的circRNA，該基因參與編碼內吞作用和膜受體內在化的蛋白質。circ_0000338通過耐奧沙利鉑HCT116細胞系（HCT116-R）分泌的外泌體選擇性轉移到共培養的親本HCT116細胞系（HCT116-P）后，與對照細胞相比，HCT116-P細胞在藥物治療中的生存力顯著提高[30]。外泌體中circ_0000338上調可作為早期預測結直腸癌化療藥物耐藥性的潛在生物標志物[30]。

惡性腫瘤通常依靠有氧糖酵解來產生三磷酸腺苷，以實現快速生長和化療藥物的耐藥性。M2-PK在催化糖酵解中起關鍵作用。有研究結果顯示，M2-PK在結直腸癌細胞中的表達有異質性，即在耐奧沙利鉑的結直腸癌細胞中較高，在奧沙利鉑敏感的細胞中相對較低。miRNA-122與化學抗性呈正相關，耐奧沙利鉑細胞的外泌體將ciRS-122傳遞至敏感細胞，通過吸附miRNA-122和上調M2-PK來促進糖酵解和耐藥性，這種細胞間的信號傳遞可提示潛在的新型治療靶點，并為外泌體在耐藥性結直腸癌中的臨床應用奠定了基礎[31]。

4 外泌體circRNA在腫瘤診斷及預后評估中的價值

circRNA在外泌體中富集并具有良好的穩定性，可從人血清、尿液等體液中檢測到。腫瘤患者體內外泌體circRNA的表達譜與健康人群有一定區別[9]。因此，外泌體circRNA具有極大的潛力作為某些腫瘤非侵入性早期診斷和預后評估的分子標志物。

與含有野生型和G13D突變體KRAS等位基因細胞系（DLD-1）和K-ras突變型結直腸癌細胞（DKO-1）相比，K-ras野生型結直腸癌細胞DKs-8中外泌體circRNA水平顯著上調，提示外泌體circRNA或可作為結直腸癌的生物標志物[35]。有研究結果顯示，與對照組相比，不同TNM分期的結直腸癌患者血清外泌體circ_0004771均顯著上調（P=0.017），circ_0004771診斷結直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.88，敏感性為80.91%，特異性為82.86%；Ⅰ～Ⅱ期結直腸癌患者血清外泌體circ_0004771顯著高于正常對照組（P＜0.001），且診斷Ⅰ～Ⅱ期結直腸癌的AUC為0.86，敏感性為81.43%，特異性為80.00%[36]。BARBAGALLO等[37]發現，結直腸癌患者血清外泌體circHIPK3顯著上調，診斷結直腸癌的AUC為0.771，敏感性為71%，特異性為80%。SHAO等[38]發現，早期胃癌（early gastric cancer，EGC）患者血漿外泌體circ_0065149顯著低于健康對照者（P＜0.001），篩查EGC的AUC為0.64，敏感性（48.7%）和特異性（90.2%）均高于傳統的腫瘤標志物（癌胚抗原、糖類抗原19-9和糖類抗原125）。另外，外泌體來源的circ_0051443表達在HCC患者血漿中下調，可抑制HCC的進展，其診斷HCC的AUC為0.808 9[39]。

LI等[28]發現，小細胞肺癌患者血清外泌體FECR1異常上調，發生遠處轉移的患者外泌體FECR1表達水平更高，且血清FECR1水平與小細胞肺癌患者的化療反應密切相關。因此，FECR1可作為評估小細胞肺癌進展的生物標志物。WANG等[40]發現肺腺癌患者血清外泌體circ_002178顯著上調，通過吸附miRNA-34和miRNA-28-5p增強細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PDL1）表達，circ_002178可作為肺腺癌的非侵入性診斷標志物，其AUC為0.996 7。CHEN等[41]全面分析了肺腺癌組和健康對照組血漿外泌體circRNA的表達譜，發現circ_0001492和circ_0001346的表達水平在早期肺腺癌中上調，但在健康對照組的血漿外泌體中幾乎檢測不到，這提示circ_0001492和circ_0001346或可作為新型肺腺癌早期候選診斷標志物。

有學者采用生物信息學分析和實時熒光定量聚合酶鏈反應技術發現circ_00005795和circ_0088088可能起競爭內源性RNA的作用，通過對比乳腺癌患者和健康對照者血清外泌體circRNA的表達，2種circRNA對乳腺癌均具有重要的診斷價值，為預測乳腺癌的發生、發展和轉移提供了理論基礎[42-43]。除此之外，外泌體來源的circRNA對前列腺癌[15]、胰腺癌[21-22]、膀胱尿路上皮癌[23]、膽管癌[27]、子宮內膜癌[44]、甲狀腺癌[45]、食管鱗狀細胞癌[46]等惡性腫瘤也有重要的診斷價值。這為尋找針對不同腫瘤的強有力的診斷標志物提供了新的方向。盡管外泌體circRNA成為新型腫瘤標志物的潛力巨大，但目前對外泌體circRNA的了解仍處于起步階段，而且大部分研究只是提出了新思路，這些分子是否可以成為腫瘤標志物仍需要進一步研究驗證。circRNA在不同腫瘤中的應用見表2。

表2 外泌體來源的circRNA在不同腫瘤中的應用

續表2

5 結論

外泌體circRNA可調節腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥，是腫瘤研究的新熱點。更重要的是，circRNA具有高度保守的特征和組織/發育特異性表達模式，可在外泌體中富集，能從體液中檢測到。因此，除了揭示腫瘤的發病機制外，探索外泌體和circRNA的聯系還有助于尋找新的潛在的腫瘤生物標志物或治療靶點。目前，僅有少數circRNA具有確定的功能或臨床應用價值。與mRNA和miRNA相比，我們對外泌體circRNA的認識還是有限的：大量的外泌體circRNA及其作用機制尚未被發現和揭示；在現有的一些研究中，外泌體circRNA對不同腫瘤的診斷價值尚缺乏實驗驗證；與循環游離circRNA相比，外泌體circRNA的優勢也尚未被驗證。因此，外泌體circRNA作為未來研究的熱點之一，其臨床應用價值還需要有足夠的理論研究結果來支持。