男性不育病人620例的遺傳學因素調查 *

武艾寧, 戴曉怡, 于榮鑫

(內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科,內蒙古呼和浩特010050)

不孕不育是世界范圍關注的生命健康問題,有統計資料顯示[1,2],不孕不育的發生率高達10%～15%,其中因男性問題導致的不育癥接近50%,以嚴重少精、弱精、畸精和無精子癥等為主要表現形式。造成生精功能障礙的原因有多種,其中遺傳缺陷(如染色體異常和基因突變)導致的不育病因占有重要地位。為了進一步明確男性不育癥的遺傳病因,本研究對近年來收集到的部分原發無精子與少精子癥病人進行細胞遺傳學核型分析和AZF基因缺失篩查,旨在為不孕不育的病因學研究及指導再次生育提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2012-03～2018-05期間內蒙古醫科大學附屬醫院遺傳咨詢門診、生殖中心就診的男性不育病例620例,年齡21～47歲,平均29.3±4.2歲,均無生育史。納入標準:(1)排除女方不育因素;(2)排除精索靜脈曲張,隱睪,梗阻性無精,逆行性射精,泌尿生殖道感染等引起的不育;(3)對病史資料、遺傳學檢測信息可能被用于流行病學研究表示知情同意。另選取230例健康男性組成對照組,全部精液參數正常并已生育且年齡與病例組匹配。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1精液分析 按照WHO診斷標準進行精液常規分析,連續三次進行精液分析,3次精液離心后,沉淀涂片均未見精子者為無精子癥;平均精子密度<20×106/L者為精液質量異常[3]。

1.2.2外周血染色體檢查 抽取外周血0.5mL行淋巴細胞培養,常規制備G顯帶,GSL120染色體自動分析系統自動采集分裂相圖像,每例計數20個核型,分析5個染色體核型,對異常核型加倍分析及計數,保存全部圖像,必要時做C顯帶或N顯帶。核型標準參照人類細胞遺傳學國際命名體系(ISCN2009)[4]。

1.2.3Y染色體微缺失(AZF)及AZFc區部分缺失的分析 不育病例根據精液分析參數進行分組,即無精子癥組和精液質量異常組,同時增加健康對照組。采用亞能生物技術(深圳)有限公司提供的AZF試劑盒進行多重PCR實驗,設定AZF區域15個STS位點,分別為:AZFa(sY82、sY84、sY86)、AZFb(sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143)、AZFc(sY239、sY242、sY254、sY255)、AZFd(sY145、sY152)進行多重PCR擴增。對未檢測出AZF基因微缺失的受檢者并對照組,行AZFc區及其附近STS位點的部分缺失分析;共8個位點分別為:sY1201(677bp)、sY1206(394bp)、sY142(196bp)、sY1258(968bp)、sY1197(453bp)、sY1291(527bp)、sY1191(385bp)、sY1161(330bp)。以上實驗過程嚴格按說明書操作,對結果異常者重復擴增3次。PCR擴增產物分析用2%瓊脂糖電泳,經Dolphin-Doc凝膠成像系統進行DNA電泳條帶觀察。

1.3 判定標準

AZF基因檢測,PCR擴增后在2%瓊脂糖凝膠電泳,對應位置上未見擴增帶的,判定為相應位點的缺失。AZF區域15個STS位點見一個或多個缺失的,判定為Y染色體AZF微缺失。待測標本僅缺失sY1291,而其余七個位點存在,疑似gr/gr缺失;待測標本僅缺失sY1191,而其余七個位點存在,疑似b2/b3缺失;待測標本同時缺失sY1291、sY1191和sY1161,其余五個位點存在,疑似b1/b3缺失。

1.4 統計學分析

所有采集數據信息經編碼整理錄入數據庫,采用SPSS20.0統計軟件進行數據處理,分類變量用頻數、百分比表示,組間比較采用采用卡方檢驗和Fisher確切概率法進行,以P<0.05為差異有統計學意義,檢驗水準α值取雙側0.05。

2 結果

2.1 不育病人的細胞遺傳學分析結果

620例不育病人按精液常規結果分組為無精子癥組(n=276)和精液質量異常組(n=344);620例不育病人中,核型異常發生率為15.65%(97/620),染色體多態性發生率為5.16%(32/620)。97例核型異常檢出者中包括性染色體異常85例,占87.63%;常染色體異常12例,占12.37%(見表1)。

2.2 Y染色體AZF基因微缺失結果

AZF檢測顯示對照組無AZF微缺失,620例不育病人中AZF缺失率為10.81%(67/620),其中無精子癥組缺失率為12.68%(35/276),精液質量異常組缺失率為9.30%(32/344),相比于精液質量異常組,無精子癥組Y染色體AZF微缺失率明顯升高(P<0.05)。本組不育病人缺失最易發生的區域為AZFc區,占68.7%(46/67),最易缺失的位點為SY152、SY255和SY254(見表2)。

2.3 AZFc區部分缺失在病例和對照中的分布情況

經AZFc區及其附近的8個STS位點的部分缺失分析,發現存在gr/gr型及b2/b3型AZFc區部分缺失類型,對照組、精液質量異常組和無精子癥組3組間在b2/b3缺失率的比較,差異有統計學意義(P<0.05);無精子癥病人b2/b3缺失率最高,精液質量差病人次之,對照組缺失率最低;此外,gr/gr缺失率的三組間比較無明顯統計學差異(P>0.05)(見表3)。

表1 男性不育病人中異常染色體及多態性核型分析結果

表3 各組AZFc區部分缺失率的比較

3 討論

男性不育最常見的臨床表現為無精子和少弱精子等精液異常,一般認為,影響精液質量的主要問題為:染色體核型異常、Y染色體微缺失、精索靜脈曲張、輸精管梗阻、隱睪、附睪損傷以及生殖泌尿道感染等,其中染色體異常和分子遺傳學水平的基因突變所引起的生精障礙估計占到男性不育的30%[5]。維持精子的發生是多基因調控的過程,染色體是基因遺傳物質的載體,當染色體結構、數目出現異常或者基因缺失均對精子生成造成影響,導致不同程度的精液質量異常。

既往研究表明[6,7],在導致原發無精子和少精子的遺傳因素中染色體核型異常是最常見的,本組研究中不育癥病例中共檢出異常核型病人97例,核型異常發生率為15.65%,與部分研究結果近似。本研究結果顯示,97例核型異常者共檢出性染色體異常85例,常染色體異常12例,分別占到核型異常人群的87.63%、12.37%,由此表明在染色體核型異常的男性不育病人中,性染色體異常是導致不育的最主要原因。其結果在于當性染色體的結構產生畸變時,將會導致某些基因功能的喪失,而性染色體數目的改變,可使多余的染色體產生劑量效應影響正常生精功能。

國內外多數研究表明,Y染色體微缺失是導致男性不育的第二大遺傳學因素,Y染色體長臂1區1帶存在有與精子生成有關的遺傳因子,稱為無精子因子(azoospermiafactor,AZF)。AZF區域的缺失是生精障礙的重要原因。Mohseni等[8]的一項大樣本研究及整合分析提示,在無精子癥和嚴重少精子癥的病人中AZF微缺失率可能占到15%。國內學者等報道原發無精癥Y染色體AZF微缺失率達8.9%,嚴重少精癥病人AZF缺失率約5%～7%,且缺失率的種族與地域差異不顯著。多項研究證實[9～11]AZF缺失病人少精子的癥狀有進行性加重及遺傳放大的可能。一般情況下,常規染色體核型分析不能評估Y染色體微缺失情況,只有通過分子檢測才能明確。最新研究證實,AZF家族共有AZFa、AZFb、AZFd、AZFc四個區域,本研究根據此劃分選擇15個STS位點進行PCR,共檢出AZF缺失67例,AZF缺失率為10.81%,相比于精液質量異常組,無精子癥組Y染色體AZF微缺失率明顯升高(P<0.05)。既往研究顯示[12],在不育病人中AZFc區缺失率最高,且存在眾多缺失類型。推斷與AZFc區接近高度重復異染色質區,遺傳物質比較容易缺失有關,Y染色體AZFc區分布著Y染色體上數量最多的睪丸組織特異性表達基因,由多種獨特的擴增子家族構成,眾多的Amplicons可發生同源重組,同源重組常造成部分基因拷貝的缺失[12],反向的相同Amplicons可在發生染色體內倒位后形成新的Amplicons排列[11],在其后的某一代中發生同源重組,故AZFc區同源重組導致的缺失類型種類眾多,臨床表現多樣,可以從正常到無精癥。本研究不育病人缺失最易發生的區域為AZFc區,占68.7%(46/67),本研究與部分文獻報道相符。在AZFc中存在著各種類型的部分缺失,本研究對部分缺失類型進行了分析,其中gr/gr缺失在AZFc區部分缺失中發生率較高,b2/b3缺失也較為常見,本研究同時發現b2/b3缺失率在對照組、精液質量異常組和無精子癥組3組間存在統計學差異(P<0.05),而gr/gr缺失率在上述三組間比較無統計學差異(P>0.05),提示b2/b3型缺失可能是男性不育的一個遺傳因素。目前多數研究認為,b2/b3型缺失導致男性不育的機制可能與DAZ3/DAZ4型缺失有關,而gr/gr缺失影響男性生育力的證據缺乏,但也有研究表明gr/gr缺失為生精異常的高風險因子[12]。有關AZFc區缺失類型及不同類型的缺失機制尚有待于進一步研究。

綜上所述,男性不育的病因復雜,遺傳學致病因素與男性不育關系密切,其中染色體核型異常和AZF基因微缺失是主要影響因素,Y染色體AZFc區b2/b3缺失可能是男性不育的高風險因子。對男性不育癥人群進行細胞與分子遺傳學技術聯合診斷有助于指導臨床優生并避免輔助生殖技術引起遺傳效應。