蒙藥藍(lán)刺頭對去卵巢大鼠BALP 、TRACP、股骨頭形態(tài)影響 *

趙 軍, 李 昕, 易媛媛, 王雄耀, 師建平, 董重陽, 常 虹, 高小明, 莫日根, 謝靜華, 劉 巖

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院; 2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院; 3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

骨質(zhì)疏松屬蒙醫(yī)經(jīng)典文獻“骨枯癥”范疇。“腎主骨生髓,髓養(yǎng)骨;腎虛骨枯髓減”等古醫(yī)籍闡發(fā),蒙醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松(osteoPorosis,OP)根本病因為腎虛。PMOP因女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退致,屬高轉(zhuǎn)換型OP。19世紀(jì)蒙醫(yī)著作經(jīng)典《觀者之喜》“老年人赫依偏盛,易骨枯,治以補為主,補暖補精,而抑赫依過剩……”[1,2]。蒙藥藍(lán)刺頭性涼,味苦,效輕、稀、柔、鈍,接骨愈傷、固骨質(zhì)[3]。本實驗通過觀察蒙藥藍(lán)刺頭對去卵巢OP模鼠血清BALP、TRACP、左側(cè)股骨頭OC骨吸收陷窩數(shù)量調(diào)節(jié),觀察BMD變化。

1 材料

1.1 實驗藥品、試劑

蒙藥藍(lán)刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園提供。強骨膠囊:北京岐黃制藥有限公司,規(guī)格:0.25g/粒,30粒/瓶,產(chǎn)品批號:188103,國藥準(zhǔn)字Z20030007。己烯雌酚片:合肥久聯(lián)制藥有限公司,規(guī)格:0.5mg/片,產(chǎn)品批號:20180925,國藥準(zhǔn)字H34021250。骨堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶 ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供);甲苯胺藍(lán)染液;5%堿性美藍(lán)溶液;PBS緩沖液。

1.2 實驗動物

4月齡Wistar大鼠雌性84只,購于內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心,合格證號:SCXK(蒙)2002-0001。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實驗樓病理實驗室飼養(yǎng),每籠12只,購回適應(yīng)環(huán)境7d左右。

2 方法

2.1 分組、模型制備

對84只大鼠隨機平均分7組(藍(lán)刺頭高劑量組、中、低劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、模型組、假手術(shù)組)。參考文獻[4]行PMOP模型復(fù)制,假手術(shù)組不切卵巢只切卵巢周圍少量脂肪,縫合創(chuàng)口后5d,將大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片[5]確定造模成功(圖1、圖2),30d后任意選取2只行子宮HE觀察(見圖3、圖4)。

2.2 藥物干預(yù)、標(biāo)本采集

90d后行藥物干預(yù)灌胃給藥。蒙藥藍(lán)刺頭低、中、高劑量組據(jù)人鼠體重比、人鼠代謝速率比折算以6.8750mg/mL、13.7500mg/mL、27.5000mg/mL給藥,臨床等效劑量低劑量組為準(zhǔn),劑量比例高、中、低為4∶2∶1。己烯雌酚0.0313mg/mL,強骨膠囊23.4375mg/mL,均按有效成人量給藥;生理鹽水體積相應(yīng)對假手術(shù)組、模型組灌胃。終每組按9只計。采血離心;剖取雙側(cè)股骨4%甲醛液固定。

2.3 顯微CT右側(cè)股骨BMD計量學(xué)指標(biāo)分析(見表1)

2.4 按BALP、TRACP試劑盒說明書步驟行,用酶聯(lián)儀測各孔吸光度(OD)值(見表2、表3)

2.5 甲苯胺藍(lán)染色方法檢測股骨頭破骨細(xì)胞骨吸收陷窩計數(shù)

2.5.1大鼠股骨脫鈣、蠟塊制備[6]

2.5.2甲苯胺藍(lán)染色 梯度酒精脫水甲苯胺藍(lán)固體(Toluidine Blue O)1.0g+70%酒精(alcohol)100.0mL+1%氯化鈉(Sodium chloride)900mL染色觀察。每組大鼠取5張切片(n0),每張切片隨機選5個視野(n1),光學(xué)顯微鏡觀察各組染色情況,采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),光鏡下骨OC骨吸收陷窩計數(shù)(n2)(見表4)。

3 統(tǒng)計方法

3 實驗結(jié)果

3.1 骨形態(tài)計量變化

表1得出,顯微CT掃描大鼠右側(cè)股骨近心端,測BMD g/cm3示:(1)模型組與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.01);蒙藥藍(lán)刺頭中、低劑量組、假手術(shù)組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組比差別明顯(P<0.01);蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組與模型組比相比差別不明顯(P>0.05);蒙藥藍(lán)刺頭低、中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組、假手術(shù)組與蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組比區(qū)別顯著(P<0.05);蒙藥藍(lán)刺頭中、低劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間比差別不明顯(P>0.05)。

表1 形態(tài)計量結(jié)果比較

3.2 大鼠血清骨堿性磷酸酶變化

表2 各組大鼠血清BALP比較

表2得出,大鼠血清骨堿性磷酸酶(BALP)表達(dá)模型組較假手術(shù)組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組明顯增高(P<0.01);蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組比差別不明顯(P>0.05);蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、假手術(shù)組比區(qū)別明顯(P<0.05);強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、假手術(shù)組比區(qū)別不明顯(P>0.05)。

3.3 大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶變化

表3 各組大鼠血清TRACP比較

表3得出,大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)表達(dá)模型組較假手術(shù)組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組明顯增高(P<0.01);蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組比差別不明顯(P>0.05);蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、假手術(shù)組比區(qū)別明顯(P<0.05);強骨膠囊組、己烯雌酚組、蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、假手術(shù)組比區(qū)別不明顯(P>0.05)。

表4 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭破骨細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)比較

表4得出,左側(cè)股骨頭甲苯胺藍(lán)染色觀察OC骨吸收陷窩數(shù)模型組與假手術(shù)組比差異顯著(P<0.05);蒙藥藍(lán)刺頭中、低劑量組、假手術(shù)組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組比差別明顯(P<0.05);蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組與模型組相比比差別不明顯(P>0.05);蒙藥藍(lán)刺頭低、中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組、假手術(shù)組與蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組比區(qū)別顯著(P<0.05);蒙藥藍(lán)刺頭中、低劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間比差別不明顯(P>0.05)。

4 討論

OP骨微結(jié)構(gòu)改變,全身骨量減少,骨脆性增加,骨折易發(fā)。OP包括原發(fā)、繼發(fā),原發(fā)最常見,多發(fā)絕經(jīng)后中老年婦女,全身老年性改變在骨骼系統(tǒng)反映。堿性磷酸酶(ALP或AKP)普遍存在于細(xì)胞質(zhì)膜的胞內(nèi)酶。ALP不單一,來自骨細(xì)胞為ALP3[7]。血清ALP主要來源于骨骼細(xì)胞、肝臟,分別稱肝特異性、骨特異性ALP。在成骨細(xì)胞(OB)表型標(biāo)志物中,BALP極為重要。BALP由骨質(zhì)中成熟階段OB原位表達(dá)分泌到細(xì)胞外后與骨基質(zhì)結(jié)合[8];骨礦化與BALP相關(guān)密切[9,10]。酸性磷酸酶存在于OC內(nèi)溶酶體酶。TRACP是其同工酶,不依賴Ⅰ型膠原降解,主存于成熟OC、有活性巨噬細(xì)胞,OB中少含,反映出骨吸收[11]。OC發(fā)育、功能是影響骨吸收重要環(huán)節(jié)。能否在骨形成骨吸收陷窩評價OC是否真正功能“金標(biāo)準(zhǔn)”[12,13]。實驗表明蒙藥藍(lán)刺頭在適當(dāng)劑量可抑制去卵巢大鼠血清BALP、TRACP表達(dá)、OC骨吸收陷窩形成,提高BMD,起一定抗骨破壞、保護骨作用。還需行大量實驗研究驗證。

綜上,大鼠在去卵巢以后血清BALP、TRACP表達(dá)、OC骨吸收陷窩數(shù)均明顯增高,BMD明顯降低;蒙藥藍(lán)刺頭具使血清BALP、TRACP表達(dá)、OC骨吸收陷窩數(shù)目明顯降低,效果同己烯雌酚、強骨膠囊相似起有效抗骨破壞、保護骨作用,為蒙醫(yī)“補暖補精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論防治PMOP提供實驗依據(jù),其詳細(xì)機制、作用通道還需進一步研究。