高效液相色譜-質譜法測定大青葉中靛藍和靛玉紅的含量 *

王巍嵩, 朱賁賁, 徐智宇

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院,內蒙古呼和浩特010050; 2.內蒙古醫科大學附屬人民醫院)

大青葉為十字花科植物松藍(IsatisindigoticaFort.)的干燥葉。性苦,寒。具有清熱解毒,涼血消斑。用于溫病高熱,神昏,發斑發疹,痄腮,喉痹,丹毒,癰腫[1]。主要產于內蒙古、陜西、甘肅、河北、山東、江蘇、浙江、安徽、貴州等地。現行藥典只規定了使用高效液相色譜法測定大青葉中靛玉紅的含量,其提取分離耗時費力,不利于大規模批量檢驗,而且也不能完全反應藥材的質量。本研究使用高效液相色譜-質譜法測定大青葉中的靛藍和靛玉紅,能較好的反應大青葉的質量,前處理簡便易行,適用于大批量檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽默飛世爾 TSQ Ultra EMR 型三重四極桿高效液相色譜-質譜聯用儀(包括UltiMate3000高效液相色譜儀);昆山市超聲儀器有限公司 KQ 5200 DE 型超聲波清洗器;梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司 XS 205 DU 型電子天平(d =0.01mg)。

1.2 試藥

靛藍對照品(批號110716-201612,含量為98.7%)、靛玉紅對照品(批號:110717-201805,含量為99.6%),均購自于中國食品藥品檢定研究院;甲酸和異丙醇均為分析純;乙酸乙酯和甲醇為色譜純;水為自制超純水,符合 GB/T6682～2008分析實驗室用水國家標準。

1.3 實驗用大青葉

自采于內蒙古呼和浩特市大青山地區,干燥后經包頭市食品藥品檢驗檢測中心菅艷艷主任中藥師鑒定其為十字花科植物松藍,即藥材大青葉。

2 實驗方法

2.1 提取與凈化

精密稱取研成粉末的大青葉約1g(精確到0.001g)置于100mL量瓶中,加入80mL乙酸乙酯,渦旋振蕩約5min,超聲處理約30min(功率300W、頻率50Hz),冷卻到室溫,加乙酸乙酯到刻度,搖勻,待用。

2.2 色譜條件

色譜柱:賽默飛世爾 Accucore C18色譜柱(100mm×2.1mm,2.6μm);流動相:5mmol/L甲酸 溶液-甲醇(80∶20,v/v)。流速:0.2mL·min-1。柱溫:20℃。進樣量:5μL。

2.3 質譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI 源)。監測模式:正離子監測模式。離子源電壓(IS):3300V。碰撞氣 (CAD)、氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)、輔助氣2(GS2)均為高純氮氣,純度為99.995%。其中氣簾氣 (CUR)172.37KPa(25psi),霧化氣(GS1)379.21kPa(55psi),輔助加熱氣(GS2)413.70KPa(60psi),碰撞氣(CAD)Medium。電噴霧電壓(IS)5000V,離子源溫度(TEM)500℃,采集時間100ms。

分別以正電離模式的 [M + H]+和負電離模式 的 [M - H]-對靛藍和靛玉紅進行 Q1分子 離子全掃描。結果表明,靛藍和靛玉紅在正電離模式下有很高的響應,其母離子(m/z)均為263.261,去簇電壓(DP)為28V;子離子(m/z)為235.12和219.07;碰撞能量(CE)分別為14V 和11V。由于235.12的碎片離子較穩定,故均選擇其作為定量離子。靛藍的保留時間為5.53min,靛玉紅的保留時間為5.62min。

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系考察 精密稱取適量靛藍和靛玉紅對照品,分別置于10mL量瓶中加乙酸乙酯適量,搖勻,再加入乙酸乙酯至刻度,制成靛藍和靛玉紅的儲備液。臨用前吸取適量儲備液制成靛藍和靛玉紅的濃度分別約為10、50、100、500、1000、5000ng·mL-1的系列濃度對照品溶液。按2.2項下方法測定分析,以靛藍和靛玉紅的峰面積對其濃度進行線性回歸,得到靛藍的線性方程為 y=19596x+790826,R2=0.9992,靛玉紅的線性方程為y=45600x+1709471,R2=0.9991。靛藍和靛玉紅在10～5000ng·mL-1內與峰面積均呈良好的線性關系。

2.4.2精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液5μL,重復測定6次,得到靛藍和靛玉紅的峰面積,結果RSD值分別為0.7%(n=6)和1.0%(n=6),表明本方法的精密度良好。

2.4.3重現性實驗 取同一樣品5份,分別制備供試溶液,得到峰面積并計算含量,結果供試品中靛藍含量 RSD 值為1.3%,靛玉紅含量的 RSD 值為1.1%,表明本方法重復性良好。

2.4.4加樣回收實驗 精密稱取已知含量的大青葉置于100mL容量瓶中,分別加入含有靛藍7.326μg(含量為98.7%)和靛玉紅26.634μg(含量99.6%)的對照品溶液,按2.2項下進行定量分析,結果如表1所示。

2.5 測定結果

根據“2.2”項下方法測定同一批大青葉樣品中靛藍和靛玉紅的含量,測定結果分別為0.06825g/100g 和0.2793g/100g,表明此方法準確可靠,適合在實踐中應用。

表1 加樣回收實驗(n=6)

3 討論

大青葉作為一種常見的中藥材,在成方制劑中也有大量的應用。本品中含有靛藍、靛玉紅、 青黛酮[2],腺苷[2]、丁香酸[3],煙酸[4]和亞油酸[5]等多種化合物,具有抗菌[6],抗病毒[7]、抗癌[8]和免疫調節作用[9]等。其質量優劣和有效成分含量直接決定了其藥理作用及藥物效價,因此對其化學成分含量的準確測定可為評價不同質量的大青葉提供衡量標準。

本研究建立了大青葉中靛藍和靛玉紅的HPLC-MS/MS 測定方法,該法重現性良好,操作簡便、 結果準確,且較高效液相色譜法樣品用量小。運用本方法對大青葉中的靛藍和靛玉紅進行檢測,能夠為大青葉的分類評級提供科學的依據,也可為其他藥品中靛藍和靛玉紅的含量測定提供參考依據。