乳腺癌病人外周血中循環腫瘤細胞的檢測及意義 *

吉 茹, 吳 敏, 趙戈昱, 郭志娟

(1.內蒙古醫科大學附屬人民醫院病理科,內蒙古呼和浩特010020; 2.內蒙古醫科大學研究生學院)

乳腺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,其發病率逐年升高,現已超過宮頸癌而躍居女性惡性腫瘤的第一位。盡管采取手術及放、化療等一系列治療方法取得了很好的療效,但復發和轉移仍是影響病人生存率和導致病人死亡的最主要因素。對于乳腺癌轉移過程的認識,“種子-土壤”學說仍是主流觀點,即腫瘤細胞自原發灶脫落,直接或經淋巴系統間接進入血循環系統形成循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC),進而在遠處組織、器官增殖,最終形成轉移灶[1]。因此早期發現血液中的CTC,對于病人預后判斷、療效評價和個體化治療都有著重要的指導作用。而且,CTC的檢測作為液體活檢的一種重要方法,具有創傷小、可連續多次檢測等特點[2]。本研究檢測乳腺癌病人外周血中CTC情況,探討其與臨床病理特征的關系及對于乳腺癌病人的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016-01～2018-12于本院乳腺外科進行手術治療的女性乳腺癌病人125例,病人年齡26～69歲,平均年齡44.7歲,其中102例為浸潤性導管癌,13例為浸潤性小葉癌,其他組織類型10例。收集同期乳腺良性腫瘤病人30例(其中乳腺纖維腺瘤22例,導管內乳頭狀瘤8例),年齡27～65歲,平均年齡43.5歲。納入標準:(1)所有病人均經手術病理確診;(2)就診前未接受任何相關輔助性治療;(3)無其他部位惡性腫瘤病史;排除標準:(1)炎性乳腺癌或機體處于急性炎癥過程中;(2)哺乳期乳腺癌。兩組受檢者一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1CTC富集方法 采用陰性富集聯合免疫熒光原位雜交法。將每例受檢者的外周血3.2mL采集至ACD 抗凝管中,應用萊爾生物醫藥公司的陰性富集方法捕獲CTC。(1)去除血漿蛋白:用CS1溶液處理血樣,650g離心5min,去上清至12mL;(2)去除紅細胞:用CS2溶液裂解紅細胞,補足液體至45mL,將離心管置于垂直混勻儀混勻,室溫放置10min,650g 離心5min,去上清至1.5mL;(3)去除白細胞:每管加入150μL 免疫磁珠(偶聯有抗人白細胞表面抗原單克隆抗體組合群),固定于搖床上,搖動15min;(4)涂片:離心棄上清液后余100μL細胞懸液,涂于正電荷處理的玻片上,滴加固定液固定；(5)imFISH:標本脫水后,加入CEP8/CEP17混合探針10μL,蓋上蓋玻片,放入雜交儀,75℃變性5min,37℃雜交1.5h,加CD45抗體行免疫熒光染色1h,滴加DAPI,封片。

1.2.2結果判讀方法 CEP8/CEP17均以信號點≥3為陽性。滿足CEP8/CEP17+,同時CD45-及DAPI +的細胞視為陽性細胞。閾值為2,即當陽性的CTC計數≥2時,該標本即可計為陽性。

1.3 統計學分析

采用SPSS22.0軟件進行統計分析,實驗結果組間比較用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌病人與乳腺良性腫瘤病人CTC檢測情況分析

125例乳腺癌病人中CTC陽性96例(76.8%),乳腺良性腫瘤病人中CTC陽性1例(3.33%),兩組比較差異有統計學意義(χ2=55.763,P=0.000)

2.2 乳腺癌病人血中CTC檢測與臨床病理特征的關系

CTC 檢測陽性與乳腺癌病人的年齡、腫瘤大小、腫瘤組織類型及組織學分級均無關(P>0.05),而與脈管侵犯及淋巴結有無轉移有關(P<0.05)(見表1)。

2.3 不同分子類型及免疫組織化學指標病人CTC表達情況

CTC 檢測陽性與乳腺癌分子分型及免疫組織化學指標ER、PR、HER2、ki-67的表達情況均無關(P>0.05)。

3 討論

循環血中腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是指在腫瘤形成或進展過程中從原發灶或轉移灶脫落入血液循環的腫瘤細胞,是連接原發腫瘤和轉移性疾病形成的重要概念。CTC能夠真實反映腫瘤負荷、具有發展為轉移病變的潛力。在轉移性疾病的條件下,對于經歷了轉移進展及隨著疾病進程參與了疾病耐藥和進展的細胞來說,CTC有望為其生物學特征和行為提供重要的洞見[3]。有研究發現,腫瘤干細胞(CSC)的表型和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)狀態的獲得之間是有相似性的。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞在形態學上發生的變化,晶體狀的上皮細胞向梭形的間質細胞表型轉變,并獲得了移行能力,從而具有較強的轉移潛能,在腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用[4]。腫瘤細胞在原發部位通過EMT的作用,侵入周圍血管。進入血液循環的腫瘤細胞,在血流的剪切力和凋亡的作用下,只有極少數能存活下來,有研究結果驗證出CTC是腫瘤干細胞中惡性程度最高的一個亞群,這些腫瘤細胞具有高度活性及高度的侵襲轉移潛能[5,6]。

表1 乳腺癌病人血中CTC陽性情況與臨床病理特征的關系

在乳腺癌中,CTC的計數已經被證實對于進展和生存來說都是重要的預后因子。有研究發現,大約30%的早期乳腺癌會出現腫瘤細胞脫落入血形成CTC,說明CTC是惡性腫瘤侵襲轉移的一個早期事件,在腫瘤形成的早期即已存在[7]。本實驗在乳腺良性腫瘤與乳腺癌病人中檢測CTC,兩組間差異有統計學意義。乳腺癌病人中CTC的檢出情況與病人的年齡、腫瘤大小、組織類型、組織學分級以及分子分型等均無關。本實驗結果中乳腺癌病人外周血中CTC陽性與有無淋巴結轉移及有無脈管瘤栓密切相關。腫瘤細胞能分泌血管內皮生長因子,促進腫瘤血管的形成從而促進腫瘤的生長。進入血循環的CTC可在血管中形成癌栓,這些CTC在一定條件下又可以通過間質-上皮轉化(MET),經血液循環播散到全身重要臟器及淋巴結形成轉移灶[8]。國外的大樣本、多中心臨床研究發現,外周血中檢出CTC可以預測乳腺癌的早期復發轉移,從而為臨床適當的治療提供依據,提高病人的生存率及生存時間,且化療后的病人CTC的存在可以作為總生存期和無進展生存期的獨立預測指標,CTC數量越多,危險度越高,生存期越短[9]。

乳腺癌的診療方法一直在不斷的提高,但是乳腺癌病人的病死率仍較高,多數是因為發生了復發及遠處轉移所致。腫瘤細胞在疾病進展的各個時期均可以從原發灶及轉移灶進入外周血循環,依靠影像學技術不能早期檢測到極微小的病灶,從而延誤了最佳的治療時機。然而,CTC檢測技術的發展,為病人帶來一種無創且敏感的方法,可以及時監測腫瘤的進展,便于臨床醫師調整治療方案,提高病人的遠期生存率及生存質量。