選擇性COX-2抑制劑尼美舒利聯合順鉑抑制肺癌細胞LRP及MDR1表達

吳 潔, 張 卿

(內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸內科,內蒙古呼和浩特010050)

在歐美國家,肺癌占常見腫瘤的首位并且仍以每年0.5%的速率增長。研究表明[1]約60%～80%的肺癌病人初次確診時已到中晚期,已無手術機會,放化療成為中晚期肺癌的主要治療手段[2]。

大部分病人在發現肺癌時已失去手術治療的最佳時機,因此放化療在NSCLC中占有重要地位。但化療的毒副作用導致病人生活質量差,耐受性差,化療后期出現耐藥等,是NSCLC化療效果不理想的重要因素。我們的前期研究發現,選擇性COX-2抑制劑NIM可誘導肺癌A549細胞凋亡、改變細胞周期分布、抑制細胞增殖;由此可能使肺癌綜合治療的療效提高[3]。本實驗探討選擇性COX-2抑制劑NIM與DDP聯合應用對肺癌耐藥細胞的逆轉作用,并初步探究其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株:人肺癌耐順鉑細胞(A 549 DDP)株購自南京博爾迪生物科技有限公司。動物:BALB-C裸鼠:雄性,4～6wk,體重18～20g,購自中國醫學科學院實驗動物研究所

1.2 方法

培養A 549 DDP細胞株：RPMI-1640培養基中加入10%胎牛血清及100U/mL青霉素及鏈霉素雙抗。PH調至7.2～7.4。在37℃,5%CO2孵育箱內培育。

A 549 DDP細胞裸鼠移植瘤模型的建立:將A 549 DDP細胞消化后,用不含血清的1640培養基洗滌2次,最后用PBS液制成細胞數為5.0×106/0.2mL的細胞懸液,于裸鼠左前肢背側皮下注射0.2mL。成功構建A 549 DDP細胞荷瘤鼠模型:接種A 549 DDP細胞3d左右開始成瘤,成瘤率達100%。移植瘤形態有圓形、卵圓形及結節型,瘤體早期平滑,體積逐漸增大后,后期部分瘤體出現破潰及結痂。成瘤期間裸鼠無其它明顯不良反應,飲食及活動正常,活力尚可,生長狀態良好。

實驗分組及藥物干預治療:將裸鼠完全隨機分為對照組、DDP組、NIM組、NIM聯合DDP組,每組8只。稱量裸鼠體重,按裸鼠公斤體重計算各組各藥使用劑量,自細胞接種后第3d開始,對照組每只每天以0.5%CMC0.2mL灌胃21d,0.9%生理鹽水0.2mL/4d腹腔注射;NIM組給予NIM 6 mg/mL連續灌胃21d;DDP組給予DDP(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;聯合組給予NIM 6 mg/mL連續灌胃21d,順鉑(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;飼養期間觀察裸鼠精神、活力、飲食及排便等一般情況。

繪制腫瘤生長曲線及計算腫瘤抑制率:連續21d藥物干預,每3d使用電子稱稱量荷瘤裸鼠體重1次、使用游標卡尺量各組腫瘤長短徑1次,繪制移植瘤生長曲線,移植瘤近似體積按公式:V=ab2/2估算[4](a,b分別為移植瘤的最長徑、最短徑)。藥物干預21d后再次稱裸鼠體重并斷頸處死動物,剝離皮下A 549 DDP細胞移植瘤,稱瘤重,計算移植瘤體積抑制率及移植瘤重量抑制率:移植瘤體積抑制率=(對照組移植瘤體積-實驗組移植瘤體積)/對照組移植瘤體積×100%;移植瘤重量抑制率=(對照組移植瘤重-實驗組移植瘤重)/對照組移植瘤重×100%

由北京d根生物技術研究提供的總RNA提取試劑盒(離心柱型)RNA simple Total RNA Kit 提取移植瘤組織總RNA。采用Thermo Fermenta K1622反轉錄試劑盒進行反轉錄。選取GAPDH為內參基因,GAPHD和目標基因引物的設計和合成均委托invitrogen生物技術公司設計并合成。設計引物:MDR1、LRP、 GAPDH進行實時熒光定量。

1.3 統計學分析

采用SPSS18.0軟件系統分析所得數據,結果分析根據是否符合正態分布;具有方差齊性采用單因素方差分析比較多組間均數的差異,方差不齊時采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 尼美舒利對裸鼠移植瘤生長的影響

腫瘤生長曲線及腫瘤抑制率:繪制腫瘤生長曲線(見圖1)。除第3d外,聯合組、NIM組、DDP組裸鼠移植瘤體積均顯著低于對照組,生長速度明顯緩慢于對照組(P<0.05),差異有統計學意義。SNK-q檢驗兩兩比較后聯合組、NIM組、DDP組的體積抑瘤抑制率分別為:72.93%、56.84%、31.35%。重量抑瘤率分別為53.41%、41.86%、21.89%;聯合組移植瘤體積顯著低于對照組及NIM組(P<0.05);對照組瘤體積顯著高于聯合組、NIM組、DDP組(P<0.05)(見表1)。

表1 對照組、NIM組、DDP組、聯合組瘤質量及體積

2.2 熒光定量RT-PCR結果統計分析

對照組、NIM組、順鉑組、聯合組LRP mRNA、MDR 1 mRNA在各組移植瘤的表達;經單因素方差分析后對照組、NIM組、DDP組、聯合組的LRP及MDR1基因表達量得出的F值分別為:25.377(P<0.01)、17.309(P<0.01)證明四組之間表達量有顯著差異。經過SNK-q檢驗后進行兩兩比較,顯示DDP組中LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達量均高于對照組、NIM組、聯合組,差異有統計學意義(P<0.01);聯合組(NIM+DDP)LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達量明顯低于其他各組差異有統計學意義(P<0.01);NIM組LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達均低于對照組及DDP組。差異有統計學意義。

3 討論

近年來,腫瘤的發生率逐步上升,尤其肺癌在全世界的總發病率呈現急劇上升的趨勢,高居惡性腫瘤榜首[5]。目前肺癌的治療方法主要為手術及放化療聯合,導致化療失敗的主要原因是腫瘤細胞對化療藥物表現出來的耐藥性,這已成為治療腫瘤的一大障礙。

肺癌化療的多藥耐藥是一個多基因、多因素的過程,主要有MDR1、LRP、P-gP、ToPo-II、GST-π等參與耐藥機制的形成[6]。這些因子通過不同的機制介導肺癌細胞對化療藥物產生抵抗。李寧等[7]研究顯示,MDR 1 mRNA的蛋白產物P-gP能通過將藥物泵出胞外使得腫瘤細胞內的藥物濃度降低而提高細胞的耐藥性。另有研究顯示[8]LRP mRNA表達的增加可導致化療藥物的耐藥,其中對順鉑耐藥的影響尤為明顯。

我們的前期研究發現,選擇性COX-2抑制劑NIM可誘導肺癌A549細胞凋亡、改變細胞周期分布、抑制細胞增殖的作用,本研究將A 549 DDP細胞培養、傳代后配制細胞懸液,接種于裸鼠皮下,并成功構建A 549 DDP細胞裸鼠皮下移植瘤模型。體內試驗表明: NIM組、DDP組、聯合組移植瘤生長遲緩,體積顯著小于對照組(P<0.05)。抑瘤率聯合組72.93%與其他組相比顯著增高(P<0.05)。提示聯合組對移植瘤生長有明顯抑制作用,聯合組較其他組別LRP、MDR1表達量明顯下調。順鉑組作用移植瘤后,其表達量更強。由此推斷應用NIM后耐藥細胞對DDP敏感性提高,尼美舒利可能對DDP化療耐藥起到了逆轉作用。

我們的研究結果顯示,選擇性COX-2抑制劑NIM聯合DDP可抑制A 549 DDP移植瘤生長的作用以及逆轉A 549 DDP對順鉑耐藥的作用。其機制可能與下調LRP、MDR1的表達有關。為肺癌的綜合治療提供了新的治療策略。