基于納米級粗糙表面甘露醇載體吸入粉霧劑的初步穩定性研究

王冠林，張雪娟，梁瑞峰，黃瑩，潘昕，吳傳斌

(1.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006； 2.暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632)

目前，肺部藥物傳遞系統已成為治療肺部疾病的主要研究方向[1]。常見肺部給藥劑型主要有吸入氣霧劑、吸入噴霧劑和吸入粉霧劑(Dry powder inhalers，DPIs)，其中DPIs以固態形式存在，穩定性高，且不含拋射劑，應用前景廣闊[2]。根據處方組成，DPIs可分為載體型和無載體型兩大類[3]。加入載體可顯著改善DPIs的流動性和分散性，并且提高制劑的貯存穩定性，目前市售的DPIs中90%以上含有載體[4]。在載體型DPIs的吸入過程中，載體攜帶藥物顆粒隨患者呼吸進入口咽部、氣管、支氣管，而在支氣管較窄處，載體由于其較大粒徑無法順利通過而沉積此處，藥物顆粒必須從載體上脫離，才可進入肺部深處[5]。研究表明，藥物與載體之間更小的脫附力可產生更高的沉積效率，而脫附力與DPIs載體表面粗糙度具有重大關聯[6-7]。因此，對載體進行表面改性，如構建粗糙表面是一種有效改善DPIs肺部藥物遞送效率的策略。

本課題前期研究中已成功采用噴霧干燥法一步構建具有可控納米級粗糙表面的改性甘露醇載體(Surface modified mannitol carrier,SMMC)，能夠顯著降低藥物與載體之間的脫附力，提高DPIs的肺部藥物遞送效率[8]，有望應用于工業化生產。對于DPIs而言，制劑穩定性直接關系到臨床用藥的安全性和有效性。本研究以布地奈德(Budesonide，BUN)為模型藥物，初步考察基于納米級粗糙表面的甘露醇載體制備的吸入粉霧劑(SMMC-DPIs)的穩定性，如影響因素穩定性、加速及長期穩定性，為其后續工業化生產、包裝、貯存、運輸條件提供相關理論依據，以保障臨床用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT系列高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)； Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex公司)；新一代藥用撞擊器(Next generation impactor,NGI，英國Copley Scientific公司)；2XZs(S)-2形旋片式真空泵(上海德英真空照明設備有限公司)；3#Turbospin?干粉吸入器(意大利PH&T公司)；LHH-250GSP藥品強光穩定性試驗箱(上海一恒集團)；KBF-115恒溫恒濕箱(德國BINDER公司)。

1.2 試藥

3#明膠膠囊(蘇州膠囊公司)；布地奈德原料藥(宜昌永諾藥業，批號：YN201709020-1)；布地奈德標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100989-201502)；甘露醇(天津大茂化學試劑廠，批號：20171101)；殼聚糖鹽酸鹽(脫乙酰度：90.2%，黏度：28 mPa·s，山東奧康生物科技有限公司，批號：160928W)；微粉化布地奈德(自制，批號：YN20180908)；納米級粗糙表面改性甘露醇(自制，批號：YN20180908，YN20181010，YN20181208)；布地奈德吸入粉霧劑(自制，批號：D20180910，D20181011，D20181210)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司，批號：165836)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 SMMC-DPIs的制備

將甘露醇和殼聚糖以質量比70∶30混合，溶解于體積分數30%乙醇溶液中(質量濃度為2%)，采用噴霧干燥法制備SMMC[8]。將SMMC與微粉化的BUN以質量比30∶1混合，批量為100 g。精密稱取上述混合粉末0.010 0 g，手動填充于3#明膠膠囊，即得SMMC-DPIs，每顆膠囊含BUN 0.3226 mg。

2.2 BUN的含量測定方法

含量測定是穩定性研究中的重要指標[9]。本研究制備的SMMC-DPIs中BUN含量低[8]，且BUN在光下易發生分子重排產生同分異構體雜質[10]，因此采用靈敏度高且可實現自動進樣的高效液相色譜法測定BUN的含量，實驗均在避光條件下完成。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；美國Phenomenex)；流動相：乙腈-水(體積比70∶30)；檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 專屬性試驗 精密稱取BUN原料藥0.010 0 g，按處方量與空白輔料甘露醇、殼聚糖物理混合，配制成BUN質量濃度約10 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進行檢測，BUN與相鄰雜質峰的分離度應符合要求。另取處方量空白輔料甘露醇和殼聚糖物理混合，按“2.2.1”項色譜條件檢測，結果見圖1?？梢?，BUN保留時間約為4.7 min，與空白輔料分離度良好，未見雜質峰，空白輔料色譜圖中未見吸收峰，甘露醇和殼聚糖在240 nm檢測波長下無吸收，對BUN的檢測無干擾。

2.2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取BUN 對照品0.016 8 g，置于10 mL的容量瓶中，加入適量無水乙醇制成1 680 μg/mL 的對照品溶液。分別精密吸取適量對照品溶液于10 mL 容量瓶中，加入無水乙醇定容成質量濃度為168.00、126.00、84.00、33.60、16.80、3.36、1.68 μg/mL的系列溶液，按“2.2.1”項色譜條件進行檢測。以BUN 質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程A=34 984c+ 20 021.3(R2=0.999 9，n=7)，表明BUN在1.68～168 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

A.供試品溶液； B. BUN對照品溶液； C.空白輔料。

2.2.2.3 精密度試驗 精密稱取BUN 對照品0.005 0 g，置于100 mL的容量瓶中，加入無水乙醇制成50 μg/mL 的對照品溶液，并通過稀釋得到質量濃度為10 μg/mL和2 μg/mL的溶液。取高、中、低3個濃度的樣品溶液分別按“2.2.1”項色譜條件重復進樣5次，測定峰面積，計算RSD值。結果測得高、中、低3個質量濃度溶液的RSD值分別為0.67%、1.11%、1.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.4 穩定性試驗 精密稱取BUN對照品0.005 0 g，置于100 mL的容量瓶中，加入無水乙醇制成50 μg/mL 的對照品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h測定BUN濃度，計算峰面積的變化。結果測得峰面積RSD值為0.64%，表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.2.2.5 回收率試驗 精密稱取3份BUN對照品各0.010 0 g，按處方量加入輔料，用無水乙醇配成含BUN高、中、低濃度分別約為20、15、10 μg/mL的溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，根據標準曲線計算測得量，由測得量和加入量計算回收率，結果顯示低、中、高3個質量濃度的平均回收率在99%～102%之間，RSD均小于2%，表明方法準確穩定。

2.3 穩定性研究考察項目

根據《中國藥典》2020年版四部通則[11]和吸入制劑研究技術質量控制指導原則[12]，考察SMMC-DPIs的外觀性狀、排空率、遞送劑量均一性(Delivery dose uniformity，DDU)、微細粒子劑量(Fine particle dose，FPD)和空氣動力學粒徑分布(Aerodynamic particle size distribution，APSD)，進而評價制劑高溫、高濕及強光影響因素穩定性，加速試驗穩定性和長期試驗穩定性。

2.3.1 外觀性狀 本品內容物應為白色疏松粉末，膠囊殼結構完整。

2.3.2 遞送劑量均一性 根據《中國藥典》2020年版四部通則“0111吸入制劑通則”[11]，采用吸入粉霧劑遞送劑量均一性測定裝置測定SMMC-DPIs遞送劑量(Delivery dose，DD)：取待測膠囊1顆，置于吸入裝置內，啟動真空泵抽吸4 s，氣流流速為60 L/min，以無水乙醇清洗濾紙和收集管內部，合并清洗液測定BUN含量。重復上述操作，共測定10顆膠囊。

2.3.4 空氣動力學粒徑分布和微細粒子劑量 根據《中國藥典》2020年版四部通則“0951吸入制劑微細粒子空氣動力學特性測定法”[11]，采用NGI及HPLC測定SMMC-DPIs的APSD，并采用CITDAS軟件(英國Copley Scientific公司)計算FPD，評價DPIs的肺部藥物遞送效率[13-15]。取待測膠囊置于吸入裝置中，啟動真空泵抽氣每顆4 s，每次10顆，氣流流速為60 L/min。分別收集并測定吸入器和適配器、L型連接管、預分離器、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和MOC藥物含量。每個處方重復3次，取平均值并計算標準偏差(Standard deviation,SD)。

2.4 吸入粉霧劑影響因素試驗

取自制SMMC-DPIs暴露于高溫(60±0.5)℃，高濕[(90±5)%RH和(75±5)% RH)]和強光[(4 500±500) lx]條件下，分別于第0、5、10 d按“2.3”項穩定性考察項目對SMMC-DPIs進行考察。

2.5 吸入粉霧劑加速穩定性試驗

取自制SMMC-DPIs，采用鋁塑泡罩包裝后與袋裝干燥劑一起裝入鋁袋并密封，在(40±2)℃、(75±5)%RH的條件下放置第1、2、3個月末時分別取樣1次，按“2.3”項穩定性考察內容進行檢測。

2.6 吸入粉霧劑長期穩定性試驗

取自制SMMC-DPIs，采用鋁塑泡罩包裝后與袋裝干燥劑一起裝入鋁袋并密封，在(25±2)℃、(60±10)%RH的條件下放置0、3、6個月時取樣，按“2.3”項穩定性考察項目進行檢測。

3 結果與分析

3.1 吸入粉霧劑影響因素試驗

影響因素試驗考察結果如表1所示。可見，SMMC-DPIs在高溫和強光條件下樣品外觀性狀未見明顯變化，同批次試驗10顆膠囊遞送劑量均在平均值75%～125%之間，排空率大于90%，FPD大于標示劑量的10%，符合《中國藥典》要求。同時，10 d內DD、ED和FPD間的差異無統計學意義(P>0.05)。APSD如圖2所示，與0 d相比，在高溫(圖2A)和強光(圖2B)條件下貯存10 d對DPIs體外沉積各級分布無顯著影響，制劑的吸入性能基本不變。

由于樣品在25 ℃、(90±5)%RH條件下放置5 d后，吸濕增重超過5%，故改為在25 ℃、75%RH條件下進行高濕穩定性試驗。高濕條件貯存5 d后觀察到樣品外觀性狀無明顯變化，但是貯存10 d后部分膠囊殼軟化。DD和排空率與0 d相比差異無統計學意義(P>0.05)，但是FPD略有下降(P<0.05)，原因可能是樣品吸濕團聚導致其空氣動力學粒徑增大，從而使得DPIs在預分離器處沉積增加，在S3～S6處沉積減少，因此FPD下降。APSD如圖2C所示，樣品在預分離器沉積增加，在S3～S6 4個撞擊盤的沉積減少(在測試氣流下，預分離器截留粒徑>8.06 μm，S3～S6截留粒徑為0.55～4.46 μm[16])，表明可能存在粉末團聚現象，將內容物從膠囊殼中傾倒出來時，也發現有極少量細粉黏附于膠囊殼內壁上，這可能是水分滲透明膠膠囊殼，囊殼軟化所致。貯存10 d后吸濕增重百分率為(4.65±0.26)%，也進一步表明在高濕條件下確實存在囊殼吸濕現象。一方面，囊殼吸濕后易發生軟化或裂片，阻滯膠囊內容物隨氣流的分散；另一方面，囊殼吸濕可能使得內容物顆粒團聚，嚴重影響DPIs的吸入性能。研究表明，膠囊殼的水分含量會影響其軟硬程度和彈性，而明膠膠囊殼的含水量為12.5%～17.5%，在較高的相對濕度條件下容易吸濕軟化[17]。

由影響因素試驗結果可知，SMMC-DPIs在高溫和強光條件下性質穩定，而在高濕環境中穩定性較差，提示應采用鋁塑泡罩包裝，并密封于干燥環境中貯存，推薦采用新型HPMC膠囊殼，其含水量僅為2%～7%，在較寬的相對濕度(0%～75%)范圍內均可保持正常外觀，不發生碎片等異常情況，抗濕能力顯著優于明膠膠囊[17]，更適合作為吸入制劑膠囊殼。

3.2 吸入粉霧劑加速穩定性試驗

加速穩定性試驗結果如表2所示。可見，SMMC-DPIs在(40±2)℃、(75±5)%RH的加速條件下貯存3個月后，膠囊殼完好，未見明顯變化，內容物仍為白色疏松粉末，未見團聚現象。但將內容物從膠囊殼中傾倒出來時，可發現有極少量細粉黏附于膠囊殼內壁上，貯存3個月后吸濕增重百分率為(1.97±0.31)%，符合《中國藥典》相關規定。此外，DPIs的DD和FPD與0月樣品間的差異無統計學意義(P>0.05)，其ED雖隨貯存時間延長略有下降(P<0.05)，但均大于90%，符合《中國藥典》相關規定[11]。從圖3A可見，供試樣品的APSD值在NGI各級分布基本不變，說明3個月內樣品吸入性能未發生變化，可初步認為制劑在加速穩定性3個月試驗中穩定，符合《中國藥典》的規定[11]。

表1 影響因素試驗結果

A.高溫條件(60 ℃)； B.強光條件[(4 500±500) lx]； C.高濕條件[(75±5)%RH]

表2 加速和長期穩定性試驗結果

3.3 吸入粉霧劑長期穩定性試驗

長期穩定性試驗結果如表2所示。可見，SMMC-DPIs在(25±2)℃、(60±10)% RH條件下貯存3個月后膠囊殼完好，未見軟化變形，內容物仍為白色疏松粉末，未見團聚或變色，吸濕增重百分率為(1.45±0.21)%，DD、ED和FPD也未發生顯著變化(P>0.05)，從圖3B可見APSD值也基本不變，說明3個月內樣品吸入性能未發生變化，可初步認為制劑在長期穩定性3個月試驗中穩定，符合《中國藥典》相關規定[11]。

在鋁塑泡罩包裝條件下樣品加速和長期穩定性試驗表明，SMMC-DPIs在貯存3個月后，膠囊殼未出現軟化現象，DD間的差異無統計學意義(P>0.05)，ED和FPD符合《中國藥典》規定[11]，吸入性能基本不變，說明SMMC-DPIs在加速穩定性試驗和長期穩定性試驗中穩定性良好，可長期貯存，有望應用于工業化生產。但由于研究時間所限，加速穩定性試驗和長期穩定性試驗數據僅收集到3個月，后續將繼續考察其6、9、12、18、24個月的長期穩定性試驗，為制定SMMC-DPIs的有效期提供更多依據。

A.加速穩定性試驗； B.長期穩定性試驗。

藥物制劑穩定性是制劑研究、開發與生產中的關鍵[18]。若DPIs的穩定性在生產、運輸和貯存過程中發生改變，可能影響到DPIs的肺部有效沉積率，進而導致藥效降低甚至出現嚴重的不良反應。對于DPIs而言，載體可改善DPIs的流動性、分散性從而提高肺部藥物遞送效率，是提高制劑療效的關鍵組成，也是影響制劑穩定性的重要因素，本研究可為后續工業化生產提供相關理論依據。